高效液相色谱 (5).ppt

一、建立HPLC分析方法的一般步骤4.分析条件的优化温度流速检测条件进样量第26页，共44页，星期日，2025年，2月5日一、建立HPLC分析方法的一般步骤6、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。制备标准工作曲线精密度试验重复性试验加标回收率试验样品稳定性考察5、建立分析方法并验证第27页，共44页，星期日，2025年，2月5日*二、实验技术（一）样品处理1.溶剂萃取HPLC分析通常是使用与水不混溶的有机溶剂从水相中萃取待测的有机化合物。常用有机溶剂：氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁烷等萃取次数：3～5次萃取液处理：合并萃取液，进行蒸发浓缩，在用适当的有机溶剂（如色谱纯甲醇）溶解。第28页，共44页，星期日，2025年，2月5日*利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与基体分离，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，适当处理（蒸发浓缩）后用适当溶剂溶解，供HPLC测定。（一）样品处理2.固相萃取二、实验技术第29页，共44页，星期日，2025年，2月5日*（一）样品处理二、实验技术3.样品过滤用0.45um的微孔滤膜的样品过滤头过滤。第30页，共44页，星期日，2025年，2月5日*1.过滤：流动相用0.45μm的微孔滤膜过滤2.脱气：离线脱气、在线脱气二、实验技术（二）流动相处理不能使用腐蚀性的溶剂。如强酸。流动相不能含有任何颗粒。流动相中无机盐的浓度要尽量小(一般几十mmol/L)分析完成要及时用足量的水将缓冲盐冲走，然后用甲醇或乙腈冲洗系统。第31页，共44页，星期日，2025年，2月5日关于高效液相色谱(5)第1页，共44页，星期日，2025年，2月5日一、液固吸附色谱法固定相：硅胶：YWG(无定形)5~6umYQG(球形)3~4um原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物采用来固体吸附剂作为固定相高分子多孔微球：YSG原理：吸附+分配兼小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物第2页，共44页，星期日，2025年，2月5日一、液固吸附色谱法流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂例：正己烷或庚烷+氯仿---分离机理:利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱硅胶吸水量↑，LSC→LLC第3页，共44页，星期日，2025年，2月5日二、液液分配色谱法固定相：固定液——极性→NLLC固定液——非极性→RLLC载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用正相色谱——固定液极性流动相极性（NLLC）反相色谱——固定液极性流动相极性（RLLC）流动相：各种溶剂第4页，共44页，星期日，2025年，2月5日正相色谱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分分离机理:利用组分在两相中溶解度的差异二、液液分配色谱法第5页，共44页，星期日，2025年，2月5日三、反相键合相色谱法固定相：采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37（ODS，C18）、硅胶-苯基等流动相：极性较强的溶剂+极性调节剂：一般以水为基础溶剂例：水+甲醇，乙腈，THF第6页，共44页，星期日，2025年，2月5日分离机理——疏溶剂作用理论非极性的烷基键合相——硅胶表面的十八烷基“分子毛”——较强的疏水特性。三、反相键合相色谱法第7页，共44页，星期日，2025年，2月5日分子中非极性部分——疏水烷基——缔合作用，分子保留分子极性部分——极性流动相——离开固定相，减小保留两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为溶质分子：同系物中，碳数越多，K越大引入极性基团，K值变小引入非极性基团，K值变大流动相：流动相的极性增加（增加水的含量），K值变大。溶质的离解程度越高，K