《细胞凋亡与生存》课件.pptVIP

*************************************流式细胞术在凋亡检测中的应用原理与优势流式细胞术（FCM）是一种高通量单细胞分析技术，能同时检测多个参数，分析大量细胞（10,000），提供定量数据。FCM在凋亡研究中的主要优势包括：高灵敏度和特异性；能区分不同凋亡阶段；可同时检测多个凋亡标志；样本制备简便；分析速度快；可与细胞分选结合进行后续研究。检测参数FCM可检测多种凋亡相关参数：①DNA含量分析：PI染色检测亚二倍体峰（SubG1），代表DNA降解；②膜完整性：PI或7-AAD排斥试验；③磷脂酰丝氨酸外翻：AnnexinV结合分析；④线粒体膜电位：JC-1、DiOC6或TMRE荧光强度变化；⑤Caspase活性：特异性荧光底物或抗体检测；⑥细胞周期分析：评估细胞周期阻滞或调亡细胞比例。多参数分析FCM的突出优势是能进行多参数联合分析，获取更全面的凋亡信息。常见组合包括：①AnnexinV/PI双染：区分早期凋亡（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡（AnnexinV+/PI+）和坏死（AnnexinV-/PI+）；②线粒体功能/Caspase活性联合检测：了解凋亡信号级联顺序；③细胞表面标志物/凋亡标记物联合分析：识别混合细胞群中特定亚群的凋亡状态；④细胞周期/凋亡联合分析：研究细胞周期与凋亡的关系。TUNEL法检测细胞凋亡基本原理TUNEL(TerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPNickEndLabeling)法是一种检测DNA断裂的特异性技术。它利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）识别DNA断裂处的3-OH游离端，催化标记的dUTP（如生物素-dUTP、荧光-dUTP）加入到断裂点。凋亡细胞中大量DNA断裂使标记信号明显增强。实验步骤①样本固定：甲醛或乙醇固定细胞或组织切片；②细胞通透化：使用TritonX-100等渗透剂处理，使酶和核苷酸能进入细胞核；③阻断内源性过氧化物酶（如用组织切片）；④TdT酶促反应：在TdT存在下，标记的dUTP掺入DNA断裂处；⑤信号检测：荧光显微镜观察（荧光标记）或通过生物素-链霉亲和素系统显色（生物素标记）。应用优势TUNEL法具有多种优势：高灵敏度，可检测单个凋亡细胞；适用于不同样本类型（培养细胞、组织切片、流式细胞术样本）；可保留组织结构信息，了解凋亡细胞的空间分布；可与其他标志物联合检测，识别特定细胞类型的凋亡；能检测到DNA片段化早期阶段，不需等待典型的DNA梯状条带形成。局限性TUNEL法也存在局限性：某些坏死细胞也可产生TUNEL阳性信号；DNA修复过程中的单链断裂可能导致假阳性；固定过程中的DNA断裂可产生背景信号；不能区分凋亡、自噬和程序性坏死；灵敏度受样本处理方法影响大；需结合形态学或其他生化标志物确认凋亡。AnnexinV检测细胞凋亡AnnexinV检测法基于凋亡早期细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从内层翻转到外层的特性。AnnexinV是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能特异性与PS结合。正常细胞中，PS位于细胞膜内侧；凋亡早期（DNA断裂和形态学改变之前），PS外翻，AnnexinV可与之结合。通过荧光标记的AnnexinV（如AnnexinV-FITC），可检测和定量分析凋亡细胞。结合碘化丙啶（PI）双染，可区分不同阶段的凋亡细胞：早期凋亡细胞（AnnexinV+/PI-）膜完整但PS外翻；晚期凋亡或坏死细胞（AnnexinV+/PI+）膜通透性增加，PI可进入细胞与DNA结合；活细胞（AnnexinV-/PI-）双染阴性。这种双染法可通过流式细胞术或荧光显微镜进行分析。AnnexinV检测法的优势在于能检测早期凋亡，灵敏度高，可定量分析，操作简便。Caspase活性检测荧光底物法利用含特异性Caspase切割位点的荧光底物。如Caspase-3底物Ac-DEVD-AMC，切割后释放荧光团AMC；Caspase-9底物LEHD-AFC等。通过测定荧光强度，可定量分析Caspase活性。该方法灵敏度高，可用于活细胞实时检测，但底物特异性有限，各Caspase之间存在交叉反应。抗体检测法利用识别活化Caspase的特异性抗体。Westernblot可检测Caspase前体减少和活性片段增加；免疫组化/免疫荧光可显示Caspase在细胞内的激活和定位；ELISA可定量检测活化的Caspase水平。该方法特异性高，可识别特定Caspase的激活状态。活性位点探针法利用与Caspase活性位点共价结合的标记探针。如生物素化的VAD-FMK(bV