《细胞学实验技术》课件.pptVIP

*************************************基因敲降技术：siRNA小干扰RNA(siRNA)是一种21-23个核苷酸的双链RNA分子，能够特异性降解与其序列互补的mRNA，导致相应基因表达下调。siRNA通过RNA干扰(RNAi)机制发挥作用：首先被Dicer酶处理，然后加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)上，引导RISC特异性切割目标mRNA。siRNA可通过化学合成获得，也可通过体外转录或表达载体在细胞内产生。siRNA转染通常采用脂质体或电穿孔等方法，效果一般在转染后24-72小时达到最大，持续时间为3-7天。为提高敲降效率，通常设计靶向同一基因不同区域的多个siRNA。siRNA的局限性包括转染效率低、效果短暂和脱靶效应等，这些问题可通过化学修饰、载体包装和序列优化等策略减轻。基因敲降技术：shRNA设计构建设计发夹结构序列，克隆至表达载体载体转染通过质粒转染或病毒转导导入细胞细胞内转录由RNA聚合酶转录为发夹结构RNA加工成熟经Dicer酶处理生成功能性siRNA基因沉默通过RISC复合物介导目标mRNA降解短发夹RNA(shRNA)是一种表达式RNA干扰技术，通过载体系统在细胞内持续表达。与合成siRNA相比，shRNA具有表达持久、成本更低、可实现稳定敲降和可调控表达等优势。shRNA通常设计为含有19-29bp茎环结构，由RNA聚合酶II或III启动子驱动表达。常用载体包括质粒、慢病毒和腺相关病毒等，可根据实验需求选择。稳定表达shRNA的细胞系通常通过抗生素筛选或荧光标记分选建立，适用于长期基因功能研究。诱导型shRNA系统（如Tet-on/off系统）允许在特定时间点控制基因敲降，有助于研究基因功能的时间依赖性。shRNA库筛选是一种高通量功能基因组学方法，可用于鉴定特定表型相关的关键基因。基因编辑技术：CRISPR-Cas9基本组成CRISPR-Cas9系统包含两个关键组分：Cas9核酸酶和单向导RNA(sgRNA)。Cas9是一种RNA引导的DNA内切酶，能在特定位点切割双链DNA。sgRNA由CRISPRRNA(crRNA)和反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)融合而成，包含一个与靶位点互补的20个核苷酸的引导序列。工作机制靶向识别依赖sgRNA与基因组DNA互补配对，同时需要靶位点附近存在原型相邻基序(PAM)。Cas9结合sgRNA形成复合物，在靶位点附近的PAM序列处结合DNA，并在PAM上游约3bp处切割双链DNA，形成双链断裂(DSB)。DSB可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)修复，从而实现基因敲除或基因组编辑。应用方式基因敲除：利用NHEJ修复过程中产生的插入/缺失导致基因失活。基因编辑：提供同源修复模板，通过HDR途径实现精确编辑。转录调控：使用失活的dCas9融合转录激活或抑制结构域。表观遗传修饰：dCas9融合组蛋白修饰酶改变靶基因的表观遗传状态。CRISPR-Cas9因其简单高效、成本低廉和多功能性，已成为基因组编辑的主流技术。与其他基因编辑技术相比，它设计简便，可同时编辑多个基因位点。近年来，CRISPR技术不断发展，包括改进的Cas9变体（如高保真SpCas9-HF1）、替代Cas蛋白（如Cas12a和Cas13）以及碱基编辑器和质粒编辑器等新工具，进一步扩展了基因组编辑的精确性和适用范围。细胞迁移实验：Transwell法基本原理利用细胞穿过多孔膜的能力评估迁移能力1实验装置上下两个小室由带微孔膜的插入物分隔趋化因子下室添加趋化因子作为迁移刺激物分析方法染色计数穿过膜的细胞数量Transwell迁移实验是研究细胞迁移能力的经典方法。实验步骤包括：将细胞悬液加入上室，趋化因子（如生长因子、血清或趋化因子）加入下室，培养一定时间（通常4-24小时）后，固定并染色穿过膜的细胞，最后通过显微镜计数或提取染料定量分析。Transwell膜通常为聚碳酸酯材质，孔径大小根据细胞类型选择（通常为8μm）。Transwell实验的关键影响因素包括细胞密度、培养时间、膜孔径大小和趋化因子浓度。为获得可靠结果，应优化实验条件并设置适当对照，如无血清对照和无细胞对照。此方法可结合药物处理，评估特定化合物对细胞迁移的影响，是肿瘤转移和伤口愈合研究的重要工具。细胞迁移实验：划痕实验1细胞培养贴壁细胞生长至完全汇合2创造伤口用无菌吸头划出线性无细胞区域3清洗培养PBS洗去脱落细胞，添加新鲜培养基4图像采集0小时和固定时间点拍照记录5数据分析测量无细胞区域减