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葡聚糖凝胶层析实验方法流程详解

一、实验准备

（一）材料准备

葡聚糖凝胶选择：依据待分离物质的分子量范围挑选适配的葡聚糖凝胶型号。如分离蛋白质，对于分子量在1000-50000的物质，可选用SephadexG-25；若分子量范围在10000-150000，则SephadexG-75更为合适。不同型号的葡聚糖凝胶孔径不同，决定了其分离物质分子量的范围。

凝胶溶胀：称取适量选定的葡聚糖凝胶干粉，缓慢加入过量的洗脱液（常见为缓冲溶液，如磷酸缓冲液pH7.0）中。在室温下，让凝胶充分溶胀，溶胀时间因凝胶型号而异，如SephadexG-25通常需3-4小时，而SephadexG-100可能需要24小时以上。溶胀过程中，不时搅拌，确保凝胶均匀接触洗脱液，充分吸水膨胀。

样品准备：将待分离的生物样品（如蛋白质混合液、多糖溶液等）进行预处理，如离心去除不溶性杂质，调整样品的pH值和离子强度，使其与洗脱液相近，以减少对分离效果的干扰。样品浓度不宜过高，以免影响分离度，一般蛋白质样品浓度可控制在1-5mg/mL。

（二）仪器与器材准备

层析柱选择：根据实验规模和需求，选择合适规格的层析柱。层析柱的长度与直径之比一般在10-100之间，常用的层析柱内径为1-5cm，长度为20-100cm。柱体应材质均匀、内壁光滑，以保证溶液在柱内均匀流动。

其他仪器：准备好蠕动泵或恒流泵，用于控制洗脱液的流速，流速精度应能达到0.1-1mL/min；检测器，如紫外检测器（用于检测具有紫外吸收特性的物质，波长根据样品而定，如蛋白质常用280nm），用于监测洗脱过程中样品的流出情况；部分实验还需配备记录仪，记录检测信号变化。此外，需准备好移液管、滴管、收集管等常规器材。

二、装柱

柱体清洗：新的层析柱使用前，先用去离子水冲洗干净，再用少量乙醇冲洗，以去除柱内可能存在的杂质和微生物，最后用大量去离子水冲洗至无乙醇残留。确保柱体清洁，避免对实验结果产生干扰。

装柱操作：将溶胀好的葡聚糖凝胶混悬液搅拌均匀，沿玻璃棒缓慢倒入已垂直固定好的层析柱内，同时打开柱下端出口，让洗脱液缓慢流出，使凝胶在重力作用下自然沉降。装柱过程中，要保持凝胶混悬液的浓度均匀，避免出现分层或气泡。当凝胶沉积至所需高度（一般为柱高的2/3-3/4）时，关闭柱下端出口，让凝胶稳定沉降一段时间，通常为30分钟至1小时。

柱效检查：装柱完成后，需检查柱效。用洗脱液以一定流速（如0.5mL/min）冲洗层析柱，待基线稳定后，注入少量已知分子量的标准样品（如蓝色葡聚糖2000，用于检测大孔凝胶的柱效；或细胞色素C，用于小孔凝胶柱效检测）。通过检测器监测洗脱曲线，计算理论塔板数（N）和不对称因子（As）来评估柱效。一般而言，N值越高、As越接近1，柱效越好。对于性能良好的葡聚糖凝胶柱，N值可达数千甚至更高，As在0.8-1.2之间。

三、上样

样品平衡：将预处理好的样品与少量洗脱液混合，在室温下放置10-15分钟，使样品与洗脱液充分平衡，减少上样后因离子强度或pH值差异导致的峰展宽。

上样操作：打开层析柱下端出口，使柱内洗脱液液面降至刚好与凝胶表面平齐，关闭出口。用移液管小心吸取适量平衡好的样品，沿柱内壁缓慢加入，注意不要冲击凝胶表面，以免破坏凝胶床的平整性。加样量一般不超过柱床体积的5%-10%，如柱床体积为50mL，上样量控制在2.5-5mL。加样完成后，打开出口，让样品缓慢进入凝胶床，待样品液面降至与凝胶表面平齐时，用少量洗脱液冲洗柱内壁2-3次，每次冲洗液体积不宜过多，一般为0.5-1mL，然后再加入适量洗脱液开始洗脱。

四、洗脱

洗脱液选择：洗脱液应根据样品性质和实验目的进行选择。对于中性或酸性样品，常用的缓冲液有磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等；对于碱性样品，可选用Tris-HCl缓冲液等。洗脱液的离子强度和pH值要保持恒定，以维持样品的稳定性和分离效果。离子强度一般在0.05-0.2mol/L之间，pH值根据样品的等电点选择，使样品在洗脱过程中保持合适的电荷状态。

洗脱流速控制：通过蠕动泵或恒流泵设置合适的洗脱流速。流速对分离效果影响较大，流速过快会导致分离度下降，过慢则实验时间过长。一般情况下，洗脱流速在0.2-1mL/min之间，对于较难分离的样品，可适当降低流速。在洗脱过程中，要保持流速稳定，避免流速波动对洗脱曲线的影响。

洗脱监测：开启检测器和记录仪，实时监测洗脱过程中样品的洗脱情况。对于具有紫外吸收的样品，根据其特征吸收波长，在紫外检测器上设置相应波长进行检测。随着洗脱液的流出，不同分子量