《分子生物学研究技术》第6章基因组编辑技术.pptx

第6章基因组编辑技术;一.背景;2.基因组编辑技术的种类;;4.三种基因组编辑技术的共同编辑方式;5.非同源末端连接法和同源重组法;5.2同源重组法

这种修复机制仅仅能在细胞核中存在同源物种的DNA的细胞中发生,主要发生在细胞周期的G2和S期。;6.位点核酸酶进行基因组编辑的可能结果;基因组编辑技术;Zinc-fingernucleases(ZFNs):将识别特定序列的锌指蛋白同Ⅱ型限制性内切酶FokI的切割结构域串联形成人工锌指核酸酶.锌指是一种常见的DNA结合蛋白结构基元，每个锌指可直接特异识别DNA双螺旋中3个连续的核苷酸。人工串联3~6个识别不同靶位点序列的重组锌指结构，能够与靶序列特异性结合。将多个锌指串联形成的ZFP结构域与IIs型限制性内切酶FokI的切割结构域相连接，就可构建成锌指核酸酶(ZFn)，实现对靶序列的切割。增加串连锌指的数目可识别更长的靶序列,同时也就增加了DNA靶向修饰的特异性。;2.ZF的上下文依赖效应;①ZF的上下文依赖效应

②脱靶剪切

③免疫原性

④ZFn设计和筛选耗时，耗力，昂贵

⑤ZFn作用位点有限

⑥大多数研究者并不公布其ZF序列

………..;基因组编辑技术;1.TALENs的研究历史;2.TALENs;2.TALENs的结构;2.1.1 例如:TALEs(AvrBs3)的结构特征和其匹配的结合位点(UPTboxes);2.1.2 TALE蛋白识别DNA碱基密码表;;;4.检测方法;4.2HR的检测方法

①体外(invitro)的SSA(Singlestrandannealing)分析方法;;5.在植物感病和抗病中TALE所扮演的角色;SyntheticTALEscanbeusedinchimericnucleases,transcriptionalactivatorsandrepressorsandhaveprovenutilityinbothmammaliancellsandplants.;;基因组编辑技术;1.CRISPR/Cas9系统的研究进程;1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序;2000年，研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，并命名为“ShortRegularlySpacedRepeats(SRSRs)”—短的规律间隔重复序列.;2.CRISPR/Cas的基因座结构

基因座结构可分别三部分，5‘端为tracrRNA基因，中间为一系列Cas蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，3’端为CRISPR基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(directrepeats)顺序排列组成。;3.CRISPR的分类

目前，CRISPR/Cas系统??为：TypeⅠ、TypeⅡ、

TypeⅢ三种不同类型。

TypeI系统分布于细菌和古细菌中，组分复杂，核心蛋白元件为Cas3蛋白，该蛋白具有DNA核酸酶和解旋酶功能。在防御外源核酸入侵时，多个Cas蛋白与crRNA形成复合物CRISPR相关病毒防御复合物CASCAD（CRISPRassociatedcomplexforantivirusdefense），促使CASCAD内的crRNA与外源DNA的互补链配对形成R环结构，Cas3的核酸酶识别R环结构后先将互补链切开，随后在Cas3的解旋酶和核酸酶作用下再将非互补链切开。;TypeII系统主要分布于细菌中，尤其是产链脓杆菌。该系统组分简单，核心蛋白元件为Cas9蛋白，Cas9蛋白与成熟的crRNA结合形成复合物即可对外源的核酸进行酶切，降解。Cas9蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc核酸酶

的活性，一个在中部有类似HNH核酸酶的活

性．嗜热性链球菌具有典型的TypeⅡCRISPR/Cas系统，它的CRISPR/Cas系统编码tracrRNA(trans-activatingcrRNA)，其指导RNaseⅢ和Cas9完成前体crRNA的成熟．随后tracrRNA还能与成熟的crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体，进而和Cas9蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能;由sgRNA,靶DNA，Cas9蛋白形成的复合物中

Cas9的晶体结构;TypeIII系统主要分布于古细菌中，在细菌中比较少见。该系统的核心蛋白元件为Cas10，具有RNA酶活性和类似于TypeI的CASCAD功能，主要参与crRNA的成熟以及对