《分子生物学研究技术》第3章目的基因的获得.pptx

第三章目的基因的获得

－目的基因的分离克隆和方法;功能基因的4个特性：

1.基因有固定的一级结构

2.每个基因在染色体上占有特定的位置

3.每个基因有特定的转录模式

4.大部分基因都有功能

基因的分离与克隆方法：

1.根据基因的功能蛋白分离目的基因

2.根据mRNA特异性分离目的基因

3.根据DNA的插入作用分离目的基因

4.基因文库技术分离目的基因

5.图位克隆分离目的基因

6.酵母双杂交系统分离目的基因;

第三章目的基因的获得

一.根据基因的功能蛋白分离目的基因

（一）技术路线

（二）相关技术

（三）基因分离 ;

;

（二）相关技术

1.蛋白质分离纯化及双向电泳

2.蛋白质氨基酸序列分析 ;蛋白的分离纯化及双相电泳;二.蛋白分离纯化的方法;方法;1.盐析与有机溶剂沉淀：;分段盐析：

半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。;有机溶剂沉淀蛋白质：

凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。

沉淀原理：

①脱水作用；

②使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。;2.透析法;3.电泳：SDS;等电聚焦电泳（IEF）;双向电泳;第三章目的基因的获得

（二）相关技术

1.蛋白质分离纯化及双向电泳

2.蛋白质氨基酸序列分析 ;蛋白质氨基酸序列分析

蛋白一级结构测定;蛋白序列测定的策略;四、多肽链的部分断裂和肽段的分离;1.酶裂解法;五、肽段氨基酸顺序测定;六、肽段在多肽中次序的决定;氨基酸序列分析例子;

;具有不同密码子的氨基酸;简并寡核苷酸探针库;利用抗体筛选表达文库

（a）把原初平板上生长的嗜菌斑及其产生的融合蛋白质原位复印转移到硝酸纤维素滤膜上；（b）滤膜与第一抗体溶液一道温浴，漂洗后加放射性标记的第二抗体继续温浴；（c）放射自显影;第四部分目的基因的获得;第三章目的基因的获得

－目的基因的分离克隆及其方法;第三章目的基因的获得; 差式显示的基本策略是通过反转录与PCR扩增mRNA中特定的一小部分，用DNA序列分析胶（6％－8％）同步分离显示扩增产物以进行比较。

首先要以5’－T（n）MN—3‘(3’固定引物．3’anchoredPrimer，其中n＝10一20，M＝dA／dC／dG，N＝dA／dC/dT／dG）作引物，将待比较的mRNA进行逆转录得到单链cDNA，由于该引物具有poly(dT），故可与mRNA的3’-poly(A)结合，而另外两个碱基MN的作用是使它定位在poly(A)5‘端．并使它只介导约1／12的mRNA的逆转录。 逆转录之后，以单链cDNA为模板，立即进行PCR，3’端引物就是上述3‘固定引物，5’端引物是10－13个碱基的随机引物。; 在细胞A中表达而不在细胞B中表达的基因．若引物合适，就可能在A的PCR产物中发现相应的基因片段，而不会在B的PCR产物中发现该片段。

5’端引物较短，特异性较低．能以相对较高的机率与cDNA5‘端结合，从而保证每一对引物都能扩增出适当数量的DNA片段(约50－150条)。若片段数过少，要对全部mRNA进行比较就必须合成大量引物，进行大量PCR；若片段数过多，又会增加分离纯化的难度。

当每次PCR扩增50—150个片段时，通过对12个3’引物和25个5’引物的不同组合，可以在95％的情况下分析15000个不同的基因，基本包括单个细胞所能表达的全部基因数。;34;35;36;37;;;;例：

印度芥菜镉胁迫响应基因的克隆与初步分析

;应用FDD技术鉴定和分离印度芥菜Cd胁迫响应基因;;Northernblot和反Northerndot-blot分析印度芥菜Cd胁迫响应上调表达基因;46;第三章目的基因的获得;48;49;;;;第三章目的基因的获得;cDNAsubtraction;cDNAsubtraction(continued);第三章目的基因的获得;57;58;第三章目的基因的获得;Differentialfilterhybridization;Filterhybridization(continued);;63;64;65;Differentialgeneexpression;Analysisofdifferentiallyexpressedgenes;Northernblotting;reverseNorthernblotting;Ribonucleaseprotectionassay;Ribonucleaseprotectionassay;Ribonu