《分子生物学研究技术》第7章外源基因表达调控1.pptx

第六章 外源基因在受体细胞内的表达调控引言表达调控的研究内容

启动子活性（promoter）增强子（enhancer）Poly(A)信号(signal)内含子（intron）不稳定因子隐含内含子序列隐含Poly(A)信号外源基因在不同水平上的表达调控整合状态基因活性调控水平DNA水平RNA水平蛋白质水平转录效率转录加工mRNA稳定性翻译效率翻译后修饰蛋白质运输整合位置效应（positioneffect）拷贝数影响（copiesnumbers）DNA再分布（DNArearrange）DNA甲基化（DNAmethylation）共抑制和反式失活（cosuppressiontrans-inactivity）剪切内含子-1起始密码边周序列（initialcode）翻译增强因子（Ω）密码剂量效应(codonbias)叶绿体线粒体核糖基化信号肽

第六章 外源基因在受体细胞内的表达调控一.转化外源基因的瞬时表达和稳定表达1.瞬时表达概念 过程2.瞬时表达的机理瞬时表达是没有整合的外源基因的表达瞬时表达是一种正常的表达方式

3.外源基因瞬时表达的影响因素质粒DNA的结构内源核酸酶的影响受体细胞生理状态(4)内源GUS酶抑制剂外源基因瞬时表达的应用在基因转化研究中的应用a.农杆菌转化能力的检测b.优化基因转化条件基因表达调控的研究外源基因的稳定表达外源基因在受体细胞中的稳定表达的条件a.时间长b.无迅速衰退现象c.分子杂交证明DNA已经整合到基因组中d.能遗传，并符合分离规律

第六章 外源基因在受体细胞内的表达调控一.转化外源基因的瞬时表达和稳定表达二.转化外源基因的同源性和异源性表达异源性表达（heterologousexpression)同源性表达（homologousexpression)异源性表达只是基因编码序列“异源”，而启动子和其它调控序列必须与受体同源

二.转化外源基因的同源性和异源性表达1.真核生物基因在植物细胞中的表达动物基因在植物细胞中不表达的原因a.启动子不能被植物细胞识别，不能起始转录（hsp70例外）b.内含子序列不同，hnRNA的加工修饰受阻。（虽然内含子边界相同GT/AG，但长度和AT含量不同，植物较短100-200bp,而且AT含量高，因此植物细胞不能切除动物内含子）c.动物细胞PolyA信号与植物不同，因此不能有效地识别d.动、植物的翻译系统的起始序列不同。动物是CACCAUG植物是AACAAUGGC所以，当用动物基因转化植物时要考虑这些差异，构建载体质粒时应采用植物的调控序列.

二.转化外源基因的同源性和异源性表达2.原核生物基因在植物细胞中的表达原核与真核基因在表达机制上有很大的差异，因此细菌的基因直接导入植物细胞是不能表达的。即使采用了植物基因的表达调控系统，没有改造的细菌基因也只能很低水平的表达。例：Bt.δ-毒蛋白抗虫基因表达量仅占植物可溶蛋白总量的0.001% 达不到抗虫的目的。原因是，mRNA结构中可能隐含有polyA信号AAUAA序列及内含子切割序列等，从而造成mRNA在不适当的位置上断裂而降解。向植物中引入Bt基因的改造。在不改变氨基酸序列的情况下，改变了20%的碱基序列，提高了GC含量，使其在植物中的表达由原来的0.001%提高到0.05~0.1%（提高了50-100倍）。抗虫效果明显提高。

向植物中引入Bt基因的改造修饰原则：优先使用植物偏爱的密码子改变基因的GC含量（36~45%），使之与植物基因GC含量一致注意XCG/XCC和XTA/XTT的比值。对植物而言，该比值低好。Thr,Pro,Ala和Ser密码子第三位避免用G。翻译起始区第4个核苷酸用G，以符合ATGGC的要求。去除隐含的poly（A）信号。如：AATAA，AATGAA，AATAAT，AATATT，GATAAA，GATAAG去除隐含的RNA聚合酶II终止序列。CAN1~9AGTNNAA清除发夹环结构。CUUCGG消除隐含的内含子剪切序列。AAG.GTAAGT等

三.转录调控序列对外源基因表达的影响1.高等植物基因的分子结构特点(图)

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三.转录调控序列对外源基因表达的影响1.高等植物基因的分子结构特点2. 5’-端表达调控序列的基本特征启动子Promoter增强子Enhancer沉默子Silencer顺式作用元件Cis-acting-element反式作用因子Trans-acting-factor启动子 确保转录精确而有效地起始的DNA序列TATAbox–25~-35负责转录起始的精确性CAATboxGCbox–80~-110 控制转录起始频率多数组成型启动子上游有（hexamermo