《分子生物学研究技术》第1章第四节质粒DNA的提取和.pptx

分子生物学研究技术;第一章

分子克隆的工具酶和载体;第四节质粒DNA的提取和

纯化;从细菌中提纯质粒DNA有多种方法，但是都包含以下3个步

骤：

细菌培养物的生长。

细菌的收获和裂解。

质粒DNA的纯化。;一、细菌培养物的生长;二、细菌的收获和裂解;大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用温和裂解法从

细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进行处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。

小质粒可用更剧烈的方法来分离。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。条件恢复正常时，质粒DNA链

迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。;一些菌株（如HB101的一些变种和衍生株??用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时会有麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带，造成质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。这些菌株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。

从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+株．如HB101）中小量制备质粒时，不要用煮沸法。煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可以避免此问题;5）所有方法只要略加修改，可适用于从1ml～1L范围内的细菌培养物。它们都可以成功地应用于从少量、大量和中等量的培养物中分离质粒DNA。除以上3）所述情况之外，任何一种方法都可适用于任何一种大肠杆菌菌株及任意量的培养物。;三、质粒DNA的制备;三、质粒DNA的制备;表1.4;小量制备质粒DNA;2．碱裂解;3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ：;用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。

用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟。

小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。

用1ml70％乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。

用50μl含无DNA的胰RNA酶（20μg／ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于 -20℃。;（二）煮沸裂解法

把细菌悬浮于含有Triton X－100、溶菌酶（消化细胞壁）的缓冲液中，然后加热到100度，使其裂解。加热破坏了细胞壁，还有助于解开DNA链的碱基对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是闭环质粒DNA虽配对破坏，可是链彼此不会分离，当温度下降恢复成超螺旋。离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，从上清液中回收质粒DNA。（对小质粒很有效）;小量制备质粒DNA;2.煮沸裂解;加25μl新配制的溶菌酶溶液10mg／ml、用10mmol／LTris·Cl（pH8.0）配制，振荡3秒钟以混匀之。如果溶液的pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。

将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。

用微量离心机于室温以12000g离心10分钟。

用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。

在上清中加入40μl5mol／L乙酸钠（pH5.2）和

420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。

于4℃以12000g离心5分钟，回收核酸沉淀。

小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。;加1ml70％乙醇，于4℃以12000g离心2分钟。

按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2～5分钟）。

用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg／ml）的TE

（pH8.0）溶解核酸，稍加振荡，贮存于-20℃。;四、质粒DNA的大量制备;步骤：;（二）细菌的收获和裂解;2、裂解;五、质粒DNA的纯化;（二）方法（略）;质粒DNA的纯化;（三）从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭;第五节在质粒载体中进行克隆的策略;质粒载体的克隆策略流程;;２、质粒DNA的去磷酸化反应;３、基因组DNA片段和质粒DNA的连接与转化;4、感受态细胞的制备;5、重组克隆的筛选与鉴定;;第五节在质粒载体中进行克隆的策略;一、连接反应的策略;具体操作：

二、线状质粒DNA的去磷酸化;3）在剩余的DNA中加入10μl 10 ×CIP去磷酸化缓冲液和适量的CIP，在适宜条件下温育。

10×CIP去磷酸化缓冲液：

10mmol／L ZnCl210mmol／L MgCl2

100mmol／L Tris·Cl