结核分岐杆菌核酸的检验PPT课件.ppt

加味当归贝母苦参丸含药血清及有效成分苦参碱对胃癌细胞增殖和细胞周期相关抑癌基因表达的影响临床分子生物学检验姓名专业学号结核分枝杆菌核酸的检测*目录结核分枝杆菌简介1结核分枝杆菌的发病趋势2结核分枝杆菌核酸的检测方法3结核分枝杆菌核酸检测的临床应用4分子生物学检验的背景5*研究背景1结核分枝杆菌，简称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。1882年，德国微生物学家罗伯特科赫（RobertKoch)首先证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。人型结核分枝杆菌主要通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径感染机体，引起多种脏器组织的结核病，其中以肺结核最为多见。*研究背景1随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。近年来，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫情死灰复燃。据世界卫生组织统计，全世界约每3个人就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成年人群中结核分枝杆菌携带率高达80％，其中约5％－10％携带者可发展为活动性结核病。*研究背景11近几年肺结核病发病率呈上升趋势,该病越来越受到人们的关注。一方面,肺结核病严重威胁患者的健康,“是单病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病;”另一方面,肺结核病具有强传染性,通过呼吸道传播。因此,患者如果没有及早得到确诊,一方面会危及患者生命;另一方面又会感染周围的人。在临床上,快速、准确地诊断肺结核,及时地进行治疗,控制病情是极为必要的。2传统上结核分枝杆菌感染机体后，抗酸菌涂片镜检、结核分枝杆菌分离培养和药物敏感性试验等常规方法仍然是世界各国细菌学诊断的主要方法，但该方法检测时限长，缺乏快速、准确的能力，总体上不能满足结核病诊断的要求。3随着分子生物学的发展及结核病分子流行病学研究、耐药性研究的新技术也逐渐建立起来。分子生物学技术在结核病研究领域里的应用，使人们能够对结核分枝杆菌进行更敏感、特异、快速、准确的检测和鉴定。其克服了常规检测技术如结核杆菌培养和生化鉴定、药敏试验存在时间长、鉴定速度慢等缺点。*核酸检测的方法聚合酶链反应1Real-timePCR2PCR-RFLP3基因芯片技术4链替代扩增技术5线性探针杂交法6扩增结核分支杆菌直接试验7GeneXpert全自动结核检测平台8*聚合酶链反应1.聚合酶链反应技术是利用体外基因扩增方法，将少到几个拷贝病原微生物的DNA扩增到常规可检测水平。1989年Hance等在世界上首次将PCR技术应用于结核杆菌检测。近年来，已建立起多种PCR技术用来检测结核分枝杆菌特异性的靶序列。PCR检出结核杆菌阳性率一般在80％以上，国外报道PCR技术比常规培养阳性率平均提高17.4％（5.8％~28.2％）表明PCR技术优于传统的细菌学法。*聚合酶链反应1.孟祥红等报道应用多重PCR技术，在同一反应体系中加入3对引物，同时扩增表达结核分枝杆菌种的MTP40特异蛋白的396bp基因序列、表达分枝杆菌属的32KD蛋白的506bp基因序列、表达结核分枝杆菌复合体群的IS6110插入序列的984bp基因序列，可以将分枝杆菌与非分枝杆菌、结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌、结核分枝杆菌与牛分枝杆菌鉴别开。在1～2d内快速、准确地鉴别出结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，为临床结核与非结核分枝杆菌病的快速鉴定提供了一个有效的手段，具有很好的临床应用前景。*聚合酶链反应1.PCR是一种简便、灵敏、快速、特异的基因诊断技术，特别适用于因排菌量少、结核杆菌发生L型变异而被常规细菌学检查漏诊者的早期诊断、鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察，标本不需要预培养，同时对肺外结核诊断也具有重要意义。常规PCR采用电泳法鉴别扩增的产物，易引起PCR产物的交叉污染，无法准确定量，再加上非特异性扩增、引物二聚体形成等，易使检测结果出现假阳性；临床标本中存在的raqDNA聚合酶抑制物质又易造成假阴性结果，因此还有待进一步改进。*逆转录聚合酶链反应①.RT-PCR是以RNA为模板，先将RNA在逆转录酶的作用下逆转录为cDNA，然后对cDNA进行PCR，使RNA在体外大量扩增。近来学者们基于原核RNA半衰期短（2～3