DB22_T2052-2014_饲料中沙门氏菌测定实时荧光PCR方法_吉林省.docxVIP

ICS07.100.30

B20

DB22

备案号：

吉

林

省

地

方

标

准

DB22/T2052—2014

饲料中沙门氏菌测定实时荧光PCR方法

DeterminationofsalmonellainfeedstuffsReal-timePCRmethod

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2052—2014

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。

本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华

人民共和国吉林出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王伟、刘晓晖、赵立群、侯宇、柴竹林、张涛。

I

DB22/T2052—2014

饲料中沙门氏菌测定实时荧光PCR方法

1范围

本标准规定了饲料中沙门氏菌的实时荧光PCR检验方法。

本标准适用于饲料中沙门氏菌的快速筛选检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T13091饲料中沙门氏菌的检验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR

实时荧光聚合酶链式反应。

Ct值cyclethresholdvalue

对样品的增菌培养物进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而

对饲料中的沙门氏菌进行快速检测。

除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA

酶污染的容器分装。

a)上游引物：5’-GTGAAATAATCGCCACGTCGGGCAA-3’

b)下游引物：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’

1

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c)

探针：5’-FAM-TTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTG–TAMRA-3’

5.2TaqDNA聚合酶。

5.3dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidine

triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP

（deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。

5.4细菌基因组DNA提取纯化试剂盒。

5.510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl），15mmol/L氯

化镁（MgCl2）。

5.6缓冲蛋白胨水（BPW）：按GB/T13091中附录规定。

5.7沙门氏菌质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的标准菌株。如CGMCC1.1859、CGMCC1.1194等。

6设备和材料

6.1实时荧光PCR仪。

6.2生物安全柜：AII型。

6.3恒温培养箱。

6.4离心机：转速≥12000r/min。

6.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.6高压灭菌器。

6.8天平：感量0.1g。

7检测步骤

取BPW增菌液1mL于1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心5min，尽量吸弃上清液，使用细菌基

因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。提取的DNA溶液可于-20℃保存。

DNA提取和纯化过程应用无菌水作为核酸提取空白对照。

取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280

nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5~2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩

增前将所有样品DNA调至10ng/μL~50ng/μL。

2

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c=A′N′50

1000

.............................................................................................(1)

式中：

c——DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）；

A——260nm处的吸光值；

N——核酸稀释倍数。

7.4实时