生物化学：第31章 DNA的重组.pptx

第31章DNA的重组（自学）;(一)Holliday模型;(二)细菌的基因转移与重组;(三)重组有关的酶;RecA蛋白的丝状聚合体与DNA的相互作用;RecA蛋白引起DNA同源重组的模型;在大肠杆菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白参与的同源重组。

（a）RuvA四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。

（b）RuvA/RuvB的作用：

（左）RuvA四聚体结合到Holliday位点；

（中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过其中心，RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。

（右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。

（c）RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。

（d）假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构模型。;几个重要例子：

1.?PhageDNA在细菌染色体DNA的特定位点上的整合或切除（开发：Invitrogen,GatewayTechnology)

2.鼠寒沙门氏杆菌的鞭毛蛋白相变

3.免疫球蛋白基因重排;特异位点重组;噬菌体的基因重组;免疫球蛋白基因的重组;（1）;重组位点有7和9nt的信号序列,中间间隔12或23bp。;在不同的核苷酸位点重组可以生成不同的蛋白质;三、转座重组;转座子具有反向末端重复序列以及在靶部位两侧产生的同向重复序列。在该例中靶序列为5bp，转座子末端由9bp反向重复序列组成，数字1-9指序列重复碱基对。;两个插入序列之间夹着一段序列（可以是某个基因，如抗性基因）。两个插入序列可以同向或反向排列，有时均有转座活性，有时只有一个有转座活性。;插入序列被转座酶基因取代，图示为Tn3(TnA家族）的结构。两端为38bp的反向重复，其两侧为5bp的靶序列，tnpA编码转座酶，tnpR编码的蛋白质可以作为解离酶（使转座子与受体DNA形成的共整合体重组和解离），也可以作为阻丫啶类丫啶类丫啶类;两个IS10组件构成一个复合转座子，它能使位于他们之间的任何DNA易位。当Tn10是一个小的圆形分子的一部分时，IS10重复序列可转座至环状分子的任一侧。;插入序列使靶序列的数量增加，在插入序列两侧各有一个;复制转座作用产生了转座子的一个拷贝，它插入到一个接受位点。给予位点保持不变，以致给予者和接受者都有转座子的一个拷贝。;非复制转座作用在未被修复的情况下，可能造成致死突变;转座子引起DNA的重排，正向重复序列的重组引起其间序列的切除或插入。;反向重复序列的重组能引起其间序列反向排列;(二)真核生物的转座因子;四、真核生物基因表达的转录前调控;6.染色质结构改变模型-组蛋白置换

占先模型(pre-emptivemodel)：决定的因素是转录因子和组蛋白谁先占据调控位点。DNA复制时，组蛋白8聚体解离，转录因子乘机结合到调控位点上，一直持续到下一个复制周期，抑制了组蛋白和DNA的结合。

例1：当5SrRNA基因与组蛋白结合时TFⅢA不能激活此基因。而TFⅢA可与游离的5SrRNA基因结合，再加入组蛋白不能使此基因失活。

例2：含腺病毒启动子的质粒能被TFⅡD结合，再被RNApolⅡ转录，如先加入组蛋白，则不起始转录，如先加入TFⅡD则形成的染色质中，模板仍能转录。

;动态模型(dynamicmodel)：组蛋白置换需输入能量。一些转录因子结合DNA时可裂解核小体，或建立一个可产生核小体定位结合位点的边界。如果蝇Hsp70启动子上的核小体在体外实行重建。GAGA(细胞核结合蛋白)转录因子与启动子中4个富含(CT)n位点结合，破坏了核小体，形成一高敏感区，而且导致邻接的核小体重排，这样它们就优先插入到随机位点。核小体打开的过程是需要水解ATP的耗能过程。;(一)PCR技术（聚合酶链式原应,PolymerasechainReaction)

以目的基因或DNA片段为模板，在引物介导及TaqDNA聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。

快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA片段。;DNA的酶合成

PCR（PolymeraseChainReaction）

①模板DNA（单链）

②引物

③DNA聚合酶

④dATP、dGTP、dCTP、dTTP

⑤一定浓度的Mg2+

合成方向：5’→3’端

?

化学合成：方向3’→5’，不需酶和DNA模板。

生物合成：方向5’→3’，需模板、引物和酶。;反应物

（1）模板

单、双链DNA或cDNA都可以作为