DB22_T2053-2014_饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法_吉林省.docxVIP

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B20

DB22

吉林省

地方标准

DB22/T2053—2014

饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法

DeterminationofAspergillusnidulansinfeedstuffsReal-timePCRmethod

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2053—2014

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。

本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华

人民共和国吉林出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王莹、郎乐、张庆波、韩冰雪、李媛媛、王庆峰。

I

DB22/T2053—2014

饲料中构巢曲霉测定实时荧光PCR方法

1范围

本标准规定了饲料中构巢曲霉的实时荧光PCR检验方法。

本标准适用于饲料中构巢曲霉的快速筛选检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T13092饲料中霉菌总数的测定

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR

实时荧光聚合酶链式反应。

对样品的培养物进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲

料中的构巢曲霉进行快速检测。

除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA

酶污染的容器分装。

a)上游引物：5’-GGCTACACCGAGGACGACAT-3’

b)下游引物：5’-CCCGCCTTAGCATCGAAGA-3’

1

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c)探针：5’-FAM-TCAACGGTGACACCCGCTCTT-TAMRA-3’

5.2TaqDNA聚合酶。

5.3dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosinatriphosphate，

脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine

triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。

5.4真菌基因组DNA提取纯化试剂盒。

5.510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl），15mmol/L氯

化镁（MgCl2）。

5.6高盐察氏培养基：按GB/T13092规定。

5.7构巢曲霉质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的标准菌株。

6仪器和设备

6.1实时荧光PCR仪。

6.2生物安全柜：AII型。

6.3霉菌培养箱。

6.4离心机：转速≥12000r/min。

6.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.6高压灭菌器。

6.8天平：感量0.1g。

7检测步骤

从培养平皿上刮取菌丝0.2g～0.5g于1.5mL离心管，使用真菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明

提取制备模板DNA。提取的DNA溶液可于-20℃保存。

取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280

nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩

增前将所有样品DNA调至10ng/μL～50ng/μL。

2

DB22/T2053—2014

c=A′N′50

1000

.............................................................................................(1)

式中：

c——DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）；

A——260nm处的吸光值；

N——核酸稀释倍数。

7.3实时荧光PCR检验

7.3.1实时荧光PCR反应体系

10×PCR缓冲液2.5μL、引物对（10μmol/L）各1μL、探针（10μmol/L）1μL、dNTP（10mmol/L）

1μL、TaqDNA聚合