DB22_T1820-2013_粮食中串珠镰刀菌的PCR检测_吉林省.docxVIP

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X04

DB22

备案号：37939-2013

吉

林

省地方标准

DB22/T1820—2013

粮食中串珠镰刀菌的PCR检测

PCRdetectionofFusariummoniliformingrains

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T1820—2013

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。

本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：史艳宇、魏春艳、刘金华、王莹、初真林、刘晓晖、周亮、王潇、张涛、王颖、

冷喜芳。

I

DB22/T1820—2013

粮食中串珠镰刀菌的PCR检测

1范围

本标准规定了粮食中串珠镰刀菌的PCR检测方法。

本标准适用于粮食中串珠镰刀菌的快速筛选检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.15食品微生物学检验霉菌和酵母计数

GB/T4789.16食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

WS/T230临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用

下列术语和定义适用于本标准。

串珠镰刀菌是一种重要的农作物病原真菌，能引起禾本科作物的根腐、茎腐和穗腐，是玉米青枯病

和穗腐病的主要病原真菌之一。

模板DNA先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的

两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作

用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP)为底物，使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一

循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。

除特别说明以外，所用试剂为分析纯或生化试剂。

1

DB22/T1820—2013

4.2马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（Potatodextroseagar，PDA）：按GB4789.15规定。

4.3CTAB缓冲液：55mmol/LCTAB、1400mmol/L氯化钠、20mmol/LEDTA、100mmol/LTris，用

10%盐酸（HCl）调pH至8.0，121℃，20min高压灭菌，储存于2℃~8℃。

4.4TE缓冲液：10mmol/LTris、150mmol/L氯化钠、2mmol/LEDTA、1%十二烷基磺酸钠，用10%

盐酸（HCl）调pH至8.0，121℃，20min高压灭菌，储存于2℃~8℃备用。

4.5RNA酶溶液（5μg/μL）。

4.6蛋白酶K（20mg/mL)。

4.7Tris饱和酚。

4.8酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）；三氯甲烷：异戊醇（24：1）。

4.9异丙醇。

4.1070%乙醇。

4.1110×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。

4.12引物

上游：5’-CTTGGTCATGGGCCAGTCAAGAC-3’

下游：5’-CACAGTCACATAGCATTGCTAGCC-3’

4.1650×TAE电泳缓冲液：称取484gTris，量取114mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，

定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成1×TAE电泳缓冲液（工作液）。

4.176×加样缓冲液：30mmol/LEDTA、36%（体积分数）甘油、0.05%（质量浓度）二甲苯腈蓝FF、

0.05%(质量浓度)溴酚蓝。

4.19阳性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的串珠镰刀菌标准菌株。

4.20阴性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的非目标菌株。

5.1天平：感量0.001g。

5.2生物安全柜：AII型。

5.3霉菌培养箱：28℃±1℃。

2

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5.5恒温水浴锅：65℃±1℃。

5.6高速冷冻离心机：转速不低于12000r/min。

5.7PCR仪。

5.8核酸电泳仪。

5.9凝胶成像分析系统。

5.10紫外分光光度计。

5.11涡旋混合器。

5.12微量移液器：0.2