DB22_T1821-2013_粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检测_吉林省.docxVIP

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X04

DB22

备案号：37940-2013

吉林省地方标准

DB22/T1821—2013

粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的

PCR检测

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T1821—2013

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。

本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：史艳宇、华蕾、刘金华、王莹、李媛媛、初真林、王伟、刘静秋、周亮、王潇、

刘晓晖、王颖、任明月。

I

DB22/T1821—2013

粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检测

1范围

本标准规定了粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检验方法。

本标准适用于粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的快速筛选。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.15食品微生物学检验霉菌和酵母计数

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

WS/T230临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用

单端孢霉烯前体（trichodiene）合成酶是催化所有真菌单端孢霉烯族化合物合成反应第一步的酶类。

根据该生化合成过程中的关键基因：单端孢霉烯前体合成酶编码基因tri5的有无来判断待检样品是否污

染了产单端孢霉烯族化合物的真菌。

4.2马铃薯-葡萄糖-琼脂（Potatodextroseagar，PDA）：按GB4789.15规定。

4.3CTAB缓冲液：55mmol/LCTAB、1400mmol/L氯化钠（NaCl）、20mmol/LEDTA、100mmol/L

Tris，用10%盐酸（HCl）调pH至8.0，121℃高压灭菌20min，储存于2℃~8℃。

4.4TE缓冲液：10mmol/LTris、150mmol/L氯化钠（NaCl）、2mmol/LEDTA、1%十二烷基磺酸钠，

用10%盐酸（HCl）调pH至8.0，121℃高压灭菌20min，储存于2℃~8℃备用。

4.5RNA酶溶液（5μg/μL）。

4.1110×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。

4.12引物

下游：5’-CATCACCTGAGGGTCCTTGT-3’

1

DB22/T1821—2013

4.13TaqDNA聚合酶。

4.14dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。

4.15分子量标记：100bpDNAMarker。

4.1650×TAE电泳缓冲液：称取484gTris，量取114mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，

定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成1×TAE电泳缓冲液（工作液）。

4.176×加样缓冲液：30mmol/LEDTA、36%（体积分数）甘油、0.05%（质量浓度）二甲苯腈蓝FF、

0.05%(质量浓度)溴酚蓝。

4.18琼脂糖：电泳纯。

4.19阳性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的禾谷镰刀菌标准菌株。

4.20阴性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的非目标菌株。

5仪器和设备

5.1天平：感量0.001g。

5.2生物安全柜：AII型。

5.3霉菌培养箱：28℃±1℃。

5.4高压灭菌器。

5.5恒温水浴锅：65℃±1℃。

5.6高速冷冻离心机：转速不低于12000r/min。

5.7PCR仪。

为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测真菌，所有培养物应小心处置。应按照

GB19489的规定执行。

8.1样品制备与培养

参照GB4789.15对样品进行稀释与培养。

从培养平皿上刮取菌丝0.2g~0.5g于1.5mL离心管，加入少许石英砂用细玻璃棒充分碾碎菌丝，

加入500μLCTAB、40μL蛋白酶K，震荡均匀，65℃水浴30min；加入500μL酚：三氯甲烷：异戊

2

DB22/T1821—2013

醇(25：24∶1)，强烈震荡，12000r/min离心15min；吸取上层水相至1.5mL离心管中，