胚胎体外培养及胚胎评估的培训.ppt

胚胎体外培养

及胚胎评估的培训孙正怡2015-12-22北京协和医院妇产科PUMCH－OBGYN

胚胎体外培养胚胎评估

空气、振动、光照…培养箱外环境人员/操作培养流程℃alarmiauto-start％O2％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0培养箱内环境气体、湿度、培养皿、油…培养液胚胎体外培养体系

培养箱外环境空气及污染物振动、噪音光照室内湿度

挥发性有机化合物VOC总挥发性有机化合物（TVOC）：熔点低于室温沸点50～260℃挥发性有机化合物的总称世界卫生组织(WHO,1989)

VOC分类苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）二异氰酸酯（TDI）二异氰甲苯酯有机氯化物（三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷）氟里昂类石油烃类有机酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等

测定VOC先俘获、后测定各种VOC的俘获方法不同测定总VOC？目前测定的“TVOC”：6~13个碳原子的苯系有机物其他VOC有各自的俘获测定方法未知VOC很难测定

尘埃粒子直径0.5um的悬浮粒子十万级：3500000/m3万级：350000/m3千级：35000/m3

光照来源：室内照明灯、显微镜光源危害：损害线粒体培养液成分分解紫外线产生活性氧，对所有细胞有害

光照豚鼠卵，超过一小时，影响后续受精和有丝分裂低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠有相反的结论——兔卵进行光照20～30分钟后，随后的受精率和着床率并未受到明显影响

相对湿度（RH）1m3空气25℃23g水蒸气10g水蒸气RH=绝对湿度/饱和湿度30℃30g水蒸气RH=43.5%RH=33.3%

理想的室内相对湿度？设备抑制霉菌人员减少液体蒸发010030~60%

培养箱内环境气体温度培养皿液滴培养方式油

气体二氧化碳培养箱CO2℃alarmiauto-start％O2％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0三气培养箱桌面式培养箱N2

气体纯度99.99%99.995%99.999%剩余的0.001%是什么？CO2

高浓度氧，胚胎基因表达异常？低氧培养改善体外胚胎发育低氧培养，人囊胚细胞数增加低氧培养

低氧培养部分文献——不必要低氧培养液内，添加了抗氧化物质（牛磺酸、丙酮酸）可能消除高氧的不利影响37.05.095.0maxmin℃%CO2%rHdesautozeroauto-startcontrolidesstart/stopIO

ASRM，2013年支持低氧环境利于囊胚形成！

低氧同样利于卵裂期胚胎LowoxygenconcentrationsforembryocultureinassistedreproductivetechnologiesStephanBontekoe1,*,EleniMantikou1,MadelonvanWely1,PublishedOnline:11JUL2012Assessedasup-to-date:4NOV2011荟萃分析，随机对照研究1382名IVF/ICSI患者20%vs5%O2活产率从32%提高到43%

温度鼠胚室温5分钟——降低卵裂率15分钟——囊胚形成率减半人卵母细胞——低温损害纺锤体

温度——纺锤体解聚与恢复33℃下，5分钟解聚，10分钟完全消失37℃后,10分钟内恢复28℃，解聚加快，恢复时间长，20分钟不能完全恢复

液滴/培养方式单独培养

集合培养胚胎自分泌、旁分泌作用减小体积适当增加胚胎数目液滴自分泌旁分泌

集合培养——依据鼠、羊、牛胚胎培养证据具体旁分泌因子未确定

集合培养——方法20～50ul2～5个胚胎/液滴盖油（石蜡油、矿物油）液滴矿物油液滴液滴

集合培养缺点：不利于单个胚胎的连续观察解决1：按Day3形态学评分分组培养8细胞碎片0～10％8细胞碎片20～40％6细胞碎片20～50％

解决2：特殊培养皿液滴

培养液培养液种类水、离子碳水化合物氨基酸pH值及缓冲物质维生素，抗生素螯合剂抗氧化物质蛋白质，大分子激素，生长因子

培养液种类序贯培养液单一培养液

序贯培养mmol/LGardner,1998

序贯培养葡萄糖不利于分裂期胚胎发育囊胚主要能量来源EDTA利于分裂期胚胎发育抑制囊胚内细胞团发育氨基酸

序贯培养系统Day1~Day3:卵裂期培养液Day3~Day6：囊胚培养液

单一培养液？单一培养：简化流程，形成率类似Day3换液Day3不换液！

pH值与缓冲物质pH：代表氢离子浓度pH与细胞各种生理功能关系极密切pH指示剂：酚红缓冲物质：维持pH稳定，成对或一种：碳酸盐缓冲对、MOPS、HEPES1pH值147

pH值与CO2浓度最重要的缓冲对碳酸盐缓冲对：HCO3-/H2