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乙型肝炎病毒基因整合对功能性治愈的影响

HBV感染是一个重要的公共卫生问题，可以导致肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌（HCC）等相关疾病。慢性乙型肝炎（CHB）的治疗目标是延缓或较少终末期肝病的发生，从而提高患者的生活质量并延长生存时间。因HBsAg阴转可显著改善CHB患者发生肝癌、失代偿肝硬化等不良结局的发生风险，以血清HBsAg消失为基本要素的乙型肝炎功能性治愈是目前国内外公认的抗病毒治疗的理想终点。功能性治愈是指完成有限疗程治疗后，血清HBsAg和HBVDNA持续检测不到、HBeAg阴转、伴或不伴HBsAg血清学转换、残留cccDNA可持续存在，肝脏炎症缓解和组织病理学改善、终末期肝病发生率显著降低。当前批准用于治疗CHB的药物包括α-干扰素和核苷（酸）类似物［NAs］，尽管可以有效抑制病毒复制，但在长期抗病毒治疗下，只有极少数CHB患者能实现功能性治愈，这除了与肝内难以清除的以微染色体形式存在的共价闭合环状DNA（cccDNA）有关外，还与HBV整合有关。整合到宿主基因组中的HBV片段可以独立于病毒的复制过程持续表达HBsAg，因此成为功能性治愈的重要障碍。本文将对近年来HBV整合方面的研究进展及其对功能性治愈的影响进行综述。

1、HBV整合的机制及编码产生的病毒蛋白

HBV复制有着独特的逆转录过程，而整合则是病毒复制过程中的副产品，并非生命周期所必须。HBV逆转录过程中若引物模板转位失败，在原位启动正链合成就会导致病毒负链和新合成的正链形成双链线性DNA（dslDNA），dslDNA为整合提供了带有两个游离末端的HBVDNA片段，而肝脏炎症引起的氧化损伤等造成的宿主基因组DNA双链断裂则为病毒整合提供了所需的断点。dslDNA入核后可通过非同源末端连接或微同源介导的末端连接插入宿主细胞染色体中。早期研究通过体外模型发现，1165A/DR1-13突变株质粒的正链引物易位有缺陷，导致线性与环状DNA的比例从1∶1升高至10∶1，在细胞中转染含有该突变的表达质粒可导致整合率的上升。外源性HBV片段在人类基因组中的整合可能会影响下游宿主基因的表达及功能，此外，整合的不断积累还会引发宿主DNA的错配修复反应，诱导基因组重排，导致细胞恶性转化过程中染色体稳定性的改变，因此HBV整合可能还具有促进肝癌发生发展的作用。

HBVdslDNA往往通过基因组上的DR1区域与宿主基因组融合，但在整合过程中可能会发生截断，所以整合可能从1820nt或更下游开始。目前大部分研究认为HBV整合在宿主染色体中呈现随机分布的趋势，但也有观点认为基因组上转录活跃的区域因解旋失去了核小体的保护而更容易损伤断裂，病毒整合可能更倾向于发生在基因富集的区域，包括CpG岛、基因编码区及启动子区，而并非真正意义上的“随机”。此外，由于HBV整合优先发生在细胞基因组双链断裂处，而DNA的损伤修复通常发生在细胞G0/G1期，因此，细胞所处的周期可能也一定程度上影响HBV整合的频率。

HBV基因组上的多个顺式作用元件，包括启动子SP1、SP2和XP及增强子EN?Ⅰ和ENⅡ在整合的前体dslDNA上均被完整保留，因而整合的HBV序列可以支持大/中/小（L/M/S）包膜蛋白及C端截短的HBx蛋白的表达，还可延伸至宿主的多聚腺苷酸信号（PAS）处终止转录进而产生具有反式激活作用的病毒-宿主嵌合蛋白。HBV整合产生的病毒蛋白可能与cccDNA来源的蛋白在功能上有所不同。HBV整合产生的截短HBx则缺乏具有促细胞凋亡特性的C端结构域，其过度表达可以抑制细胞凋亡。整合产生的截短的HBsAg不能正确分泌，积累在内质网膜中引起内质网应激和细胞氧化应激，增加DNA损伤和双链断裂，一定程度上也增加dslDNA在宿主基因组中整合的可能。鲁凤民教授团队最近的研究发现，整合HBVDNA表达的HBsAg分泌效率显著低于cccDNA，通过构建p-dslDNA体外模型，发现由整合DNA整合转录的2.4kbRNA占比以及随之而来的L-HBsAg蛋白占比均高于cccDNA，这可能是导致HBsAg分泌效率下降和肝细胞内潴留的主要原因。

从理论上而言，dslDNA上CP/BCP与编码区分离，由于缺少核心启动子序列，整合HBVDNA与cccDNA不同，存在复制缺陷，不能产生具有感染性的病毒颗粒，不能转录出前基因组RNA（pgRNA），也不能表达病毒聚合酶、HBeAg和HBcAg。但近期有研究通过第三代测序技术发现了一条长度大于3.2kb的整合HBV序列，这颠覆了以往认为整合来源的HBVDNA不能产生pgRNA的认知。同时，研究者还在整合序列中发现了多种splicedRNA，预示着同一HBV整合事件具有产生多种不同形式转录本的潜能。这些不同的观点和研究结果也强调了今后在更多临床队列中解析HBV整合