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菌悬液的制备

细菌繁殖体悬液的制备

1取第3代～第8代的营养琼脂培养基培养18h～24h的新鲜斜面培养物，用5.0mL吸管吸取3.0mL～5.0mL稀释液（除酸性电解水用生理盐水外，其他均用胰蛋白胨生理盐水溶液）加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。用5.0mL吸管将洗脱液移至另一无菌试管中，用电动混匀器混合20s，或在手掌上振打80次，使细菌悬浮均匀。

2将制成的菌悬液，进行活菌培养计数，按其结果用稀释液稀释至所需浓度，悬液定量杀灭试验时，菌悬液浓度为1×108CFU/mL～5×108CFU/mL。

3细菌繁殖体悬液冷藏保存备用，当天使用。

4怀疑有污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。

枯草杆菌黑色变种芽胞悬液的制备

1以无菌操作方式开启菌种管，加入适量营养肉汤培养基，吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0mL～10.0mL营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置36℃±1℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置36℃±1℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，置36℃±1℃培养18h～24h，即为第3代培养物。

2用10.0mL吸管吸取5.0mL～10.0mL第3代～5代的18h～24h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶（或细胞培养瓶）营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满培养基表面，将多余肉汤培养物吸出，罗氏瓶（或细胞培养瓶）置36℃±1℃恒温培养箱内培养5d～7d。

3用接种环取少许菌苔涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法：用接种环取菌苔涂于玻片上，自然干燥后，通过火焰加热将菌固定于玻片上；将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液，将平皿盖好，置55℃±1℃加热30min。取出，去滤纸，用自来水冲去残留液；加0.5%沙黄水溶液，1min后水洗，待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。在显微镜（油镜）下镜检，当芽胞形成率达90%以上时，即可进行以下处理。否则，继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。

4加10.0mL无菌蒸馏水于罗氏瓶（或细胞培养瓶）中，以L棒轻轻刮下菌苔，吸出，再加入5.0mL无菌蒸馏水冲洗培养基表面，吸出。将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中，振摇5min。

5将烧瓶置45℃水浴24h，使菌自溶断链，分散成单个芽胞。

6用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液，清除琼脂凝块。

7将芽胞悬液置无菌离心管内，以3000r/min速度离心30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，本步骤重复进行3遍。

8将洗净的芽胞悬液放入含适量小玻璃珠的烧瓶内，80℃水浴10min（或60℃水浴30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，摇匀分装后冷藏保存备用，有效使用期6个月。

9芽胞悬液在使用时，先进行活菌培养计数。

10怀疑有污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。

现场消毒评价原则

原创生命力实战老K谈管理体系生命力2024年05月29日18:10广东

1现场消毒评价的内容包括现场消毒过程评价和现场消毒效果评价。进行现场消毒效果评价前，应先进行现场消毒过程评价。

2现场消毒过程评价的内容包括消毒方案、消毒产品、消毒工作程序、个人防护。消毒方案制定应根据消毒范围、消毒对象选择合理的消毒方法和消毒产品。使用的消毒产品符合WS628等标准要求，在产品有效期内按照说明书规定的方法使用。消毒工作程序符合GB19193要求。根据病原微生物的危害程度和传播途径选择个人防护装备。

3现场消毒效果评价包括现场评价和现场模拟评价。对重大活动卫生保障和目标微生物明确的传染病疫源地、突发公共卫生事件进行现场消毒效果评价时，首选现场评价；对目标微生物无法检测、不明原因的传染病疫源地及突发公共卫生事件、风险等级较高的污染如炭疽杆菌、新冠肺炎病毒等进行消毒效果评价时选择现场模拟评价。

4现场评价是以检测消毒对象上自然菌的存在数量或（和）目标微生物是否存在作为判定依据；现场模拟评价是以检测指示微生物是否存在或存在的数量作为判定依据。

5物体表面现场模拟评价根据病原微生物对消毒因子的抗力选择相应的指示微生物。选择大肠杆菌（Escherichiacoli）8099、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538作为亲脂病毒、细菌繁殖体的指示微生物；选择白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231作为致病性真菌的指示微生物；选择龟分枝杆菌脓肿亚种(Mycobacteriumchelonaesubsp.Abscessus)CMCC93326或ATCC19977作为亲水病毒、人结核分枝杆菌的指示微生物；选择枯草