报告基因和荧光淬灭.pptxVIP

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  • 2025-06-05 发布于四川
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报告基因技术和荧光淬灭技术2008年诺贝尔化学奖由三位科学家下村脩(OsamuShimomura)、MartinChalfie和钱永健(RogerTsien)三人分享。

1962年,下村修和约翰森从维多利亚多管水母(Aequoreavictoria)中分离生物发光蛋白-水母素(aequorin)时,意外地得到了一个副产物。它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。

1974年,他们得到了这个蛋白,当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白(GFP)。GFP在水母中之所以能发光,是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。

直到1992年,道格拉斯?普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP,文章发表在《Gene》杂志上。但具有讽刺意味的是,基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义,不愿提供经费。普瑞舍一气之下,离开了科学界,将GFP的cDNA送给了几个实验室。

GFP的结构以及发光原理,要到1990年代通过X光衍射才得到证实:GFP的肽链构成一个桶状结构,在其中心由3个氨基酸携带的芳香集团构成了发光核心结构。但克隆并在真核细胞表达很长时间没成功

随后哥伦比亚大学的MartinChalfie就考虑只用它的编码区域来表达。他用PCR的方法扩增了GFP的编码区,将它克隆到表达载体中,通过UV或蓝光激发,在大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破,文章发表在《Science》杂志上。证明从水母上分离出来的GFP基因可以在其它物种上表达,正确地折叠,发出荧光。这些研究成果为GFP在生物学研究上的使用,奠定了基础。

钱永健的贡献,是利用他在活体荧光研究方面的丰富经验,对GFP进行改造,他的实验室利用定点突变改造出来EGFP,不仅提高了荧光强度,更重要的可以在普通的荧光显微镜下用现有的荧光滤镜观察到,而且光谱单一,不会和其它荧光染料的光谱发生干扰。接着他的实验室又陆续推出了不同颜色的GFP,如蓝色(BFP)和黃色(YFP)的荧光蛋白。这为同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构打下了基础

用途:构建融合表达质粒N端、C端定位,形成融合蛋白,观察细胞内蛋白质分子动态变化(pEGFP-C1,pEGFP-N1,Clontech)转基因研究,筛选转化细胞,追踪外源基因判断蛋白质分子的相互作用和距离(FRET)

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