化妆品修护功效测试体外人源成纤维细胞迁移能力测试方法.docxVIP

化妆品修护功效测试体外人源成纤维细胞迁移能力测试方法

材料准备

细胞

选用人源成纤维细胞系，如CCD-986sk细胞（购自正规细胞库）。该细胞可以模拟人体皮肤成纤维细胞的生理特性，用于实验研究。细胞复苏后，在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中，于37℃、5%CO?培养箱中培养。

试剂与药品

-不同浓度的待测化妆品样品：用DMEM培养基将化妆品样品稀释成不同浓度，如1%、5%、10%等。同时，设置阳性对照组，可选用含血小板衍生生长因子（PDGF）的培养基；阴性对照组为仅含DMEM培养基。

-胰蛋白酶-EDTA消化液：用于消化贴壁的成纤维细胞。

-磷酸盐缓冲液（PBS）：用于洗涤细胞，维持细胞的渗透压和pH值。

仪器设备

-CO?培养箱：保持细胞生长环境的温度（37℃）和气体成分（5%CO?）。

-倒置相差显微镜：用于观察细胞形态和迁移情况，并配备拍照功能，便于记录实验结果。

-超净工作台：提供无菌操作环境，防止细胞污染。

-离心机：用于细胞的离心收集。

实验步骤

细胞制备

取对数生长期的人源成纤维细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，以1×10?个/ml的密度接种于6孔板中，每孔加入2ml含10%FBS的DMEM培养基。将培养板置于37℃、5%CO?培养箱中培养24h，使细胞贴壁并生长至融合状态。

划痕处理

待细胞融合至90%-100%时，使用无菌200μl枪头在每孔细胞层上垂直划一条直线，形成宽度均匀的划痕。用PBS轻轻洗涤细胞2-3次，以去除划下的细胞碎片。

加样处理

向各孔中分别加入不同浓度的待测化妆品样品培养基、阳性对照培养基和阴性对照培养基，每孔2ml。每个浓度设置3个复孔。

观察与记录

将培养板放回培养箱中，分别在加样后的0h、12h、24h和48h，使用倒置相差显微镜观察细胞的迁移情况，并拍照记录。拍照时，在每个孔的划痕部位选取3-4个固定视野，以便后续进行准确的测量和分析。

结果分析

测量划痕宽度

使用图像分析软件（如ImageJ）对拍摄的照片进行处理，测量每个视野中划痕在不同时间点的宽度。计算每个时间点各处理组（每个浓度的化妆品样品组、阳性对照组、阴性对照组）划痕宽度的平均值。

计算细胞迁移率

细胞迁移率计算公式为：细胞迁移率（%）=[(0h划痕宽度-某时间点划痕宽度)/0h划痕宽度]×100%。

统计学分析

采用统计学软件（如SPSS）对各处理组的细胞迁移率进行数据处理。比较不同浓度化妆品样品组与阴性对照组、阳性对照组之间细胞迁移率的差异，采用单因素方差分析（ANOVA），当P0.05时，认为差异具有统计学意义。

注意事项

-实验操作应在无菌条件下进行，防止细胞污染。从超净工作台的准备、试剂的取用、培养板的处理等各个环节都要严格遵守无菌操作规程。所有的实验器具都要经过严格的灭菌处理。

-划痕操作要尽量保证直线且宽度均匀，以减少实验误差。在操作前，可以先在培养板底部做好标记，作为划痕的参考线，枪头要垂直于培养板底部进行划痕。

-拍照时，要确保显微镜的参数设置一致，包括放大倍数、亮度、对比度等，以便对不同时间点和不同处理组的照片进行准确的对比分析。