蛋白质工程课件 375页.pptVIP

Ass.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity3．外源蛋白质在酵母中的分泌表达酵母菌与其他真菌不同，只有少数蛋白质可以分泌到细胞外的培养基中，而且分泌产物的产率也很低。通过遗传操作，也相当成功地使外源蛋白，特别是一些小的蛋白(如表皮生长因子)以及非糖基化蛋白(人血清白蛋白)可以分泌表达。Ass.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity4．翻译后修饰外源蛋白在酵母细胞中可以在蛋白质二硫键异构酶的作用下形成正确的二硫键。在酵母细胞中可以产生N—和O—连接的糖基化，从而糖组分与蛋白质分子共价相连。在S．cerevlslae细胞中同样可以进行N末端乙酰化、磷酸化、烷基化以及异戊二烯化等。Ass.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达1.选择哺乳动物细胞表达体系的优点哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质，例如组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)以及人DNA酶都是用哺乳类动物细胞表达体系生产的。Ass.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity优势：①具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。②哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。Ass.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。③哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质。如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活白磷酸化和酪氨酸激酶。Ass.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，一是稳定表达系统。Ass.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1—2个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。Ass.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversityAss.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity（1）瞬时表达基因在瞬时转染时，DNA直接导入到受体细胞，其过程包括将DNA-酸钙沉淀加入到长满单层的哺乳动物细胞中，然后经甘油休克处理(glycerolshock)、细胞冲洗、加入新培养基。Ass.Prof.Liwenchhu.CollegeofAnimalScience,S