蛋白质工程课件第10章 蛋白质的修饰和表达.pptVIP

第十章蛋白质的修饰和表达第一节蛋白质修饰的化学途径用化学方法直接对蛋白质分子进行修饰有时仍然是很有用的方法，可以弥补正常生物表达体系的不足。一、功能基团的特异性修饰在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。很多在临床上重要的肽，C末端是被酰化的。但当用重组的方法得到这些产物时，其C末端是自由羧基。在自然界能进行这种酰化作用的氧化酶体系很难实用化。寻找一种有效的方法，能使C末端的谷氨酸和门冬氨酸酰胺化，而不作用于处在肽链中的谷氨酸和门冬氨酸仍是努力的方向。1．多位点取代（1）常规的氨基保护常用的取代基有两种：酸不稳定取代基，碱不稳定取代基。当其他反应完成后，可分别用无水三氟乙酸和强碱将Boc和Msc基团去除，很多多肽或小分子蛋白质在这些基团去除后仍保持其活性。（2）亚氨代乙酰基虽然绝大多数氨基取代反应至今尚没有一个可靠的方法将α—氨基和ε—氨基相区分，然而亚氨代乙酰化反应是一特例，尽管这种反应对α—氨基和ε—氨基的区分尚不十全十美。当ε—氨基几乎完全被亚氨代乙酰基所取代时，α—氨基在很大程度上可不被修饰，有时甚至达到可应用的水平。十分独特的是，被亚氨代乙酰基取代的氨基仍可解离，虽然具有稍高的pK值。就多数情况而言，在修饰后这一基团可不必从蛋白质分子上去除。只有在少数情况下，处于与蛋白质活性相关的赖氨酸残基的侧链被修饰后，导致蛋白质活性丧失。当需要去除这一修饰基团时，可用强碱进行处理。（3）其他的侧链取代羧基的甲基酯化是一个简单的反应，一般可以在室温下将蛋白质加入到含有乙酰氯的无水甲醇中来完成。由于反应产生盐酸，这类反应看上去相当剧烈，但如果将反应物及时地稀释到冰水中，小心地用碱中和盐酸就会使多肽或小分子蛋白质活力得以保持。相对于其他功能基团而言，巯基有着十分不同类型的化学反应，因此半胱氨酸残基是一个很好的靶位，利用这一靶位可以将少数的取代基团引入到蛋白质分子的确定位置。当一对半胱氨酸通过二硫键相连时，通常可加入如二硫苏醇糖之类的还原剂或通过磺酸氧化将其打开。用磺酸氧化的方法往往比简单还原的方法要好，因为磺酸氧化形成的半胱氨酸的磺酸化残基对氧化作用很稳定，而且可以通过巯基将其还原成自由巯基：2．单一的或限制性取代利用化学方法对蛋白质分子上单一的特定功能基团(如α—氨基)进行修饰而不对与其相类似的基团(如ε—氨基)产生作用是一件很困难的事。少数的化学试剂，如α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε—氨基。由于酶蛋白可以将两个极相似的基团区分开来，所以利用酶蛋白的这一特异性对蛋白质分子的功能基团进行特异性修饰应该是切实可行的。反应朝向水解方向进行的一个决定因素是在反应基质中水分子的高活性；另外一个因素是在相当宽的pH值范围内，新释放出的氨基和羧基所具有的解离倾向。需要说明的是：第一，对于成功的连接取代反应，原来肽键的断开和随后的偶联不需作为一个单一的浓缩过程。第二，此方法并不需要肽底物，没有其他的侧链，而这些侧链通常在水解反应中来满足蛋白水解酶特异性的需要。（1）α—异硫氰酸苯酯对α—氨基的选择性相对于ε—氨基而言，α—异硫氰酸苯酯对α—氨基的修饰并非绝对特异，但当试剂限制在低浓度，特别是pH值保持在足够低而使α—氨基和ε—氨基解离的程度出现最大差异时，此反应对α—氨基而言有相当的特异性。（2）在C末端产生的酶指导下的取代-蛋白质活性亲核成分的产生。（3）酶指导的C末端取代——蛋白醛的产生醛基是另一种符合下列两个条件的反应基团：第一，其反应性与蛋白质天然功能基团不同；第二，可在温和的水溶液条件下进行反应。-NH-CH（Rn）COOH+H2N-CH2-CHOH-CH2NH2（4）通过蛋白质水解的逆反应产生蛋白和肽的α——酰胺如果将R—NH2改成NH3，就可以得到一个特异性C末端被酰胺化的产物。（5）蛋白醛——由糖的化学氧化产生此方法只适用于糖蛋白，所发生的化学反应更似在高碘酸和邻位二醇之间的反应。3．次级取代上面所说的方法是位点或区域特异性地产生蛋白质活性亲核物和蛋白醛，在正常反应条件下这些衍生物可以保持其活性