蛋白质工程课件第9章 蛋白质分子设计.pptVIP

对α4的修饰：用非极性侧链残基Val、Phe、Ile替代埋藏的残基赖氨酸，使之具有更多的构象限制、增加螺旋间堆积的立体互补性。引入一个金属结合位点可减少链内侧柔性。四螺旋束Felix的设计：Hecht研究组完成。设计的目标：合成一个由不同侧链间特殊相互作用所稳定的独特的三维结构的类天然蛋白。设计的特点：避免了简单的重复序列；四螺旋中每一条都不同；每条螺旋本身没有重复的片段；包括19种天然氨基酸。设计的优点：（1）4条α螺旋均为两亲性。（2）引入二硫键：作用是减少并稳定构象熵；它可探测第一条及第四条链彼此间的取向。（3）结合了“负设计”的某些特征。设计的缺点：（1）不是非常稳定；（2）没有一个独特的很好堆积的疏水内核。构建的合成基因在E.coli中的表达的蛋白质结果：（1）谱学研究证明了Felix折叠成紧密的球形结构；（2）CD谱证明α螺旋在蛋白中占优势；（3）Cys11-Cys71二硫键的形成说明它们在三维空间结构上彼此靠近，第一条α螺旋堆积靠近第四条α螺旋；（4）二硫键在分子内而不是在分子间；（5）荧光谱证明在位置15的色氨酸埋藏在小极性环境中；（6）色氨酸接近Cys11-Cys71二硫键。Goraj等设计的Octarellin：为8股α/βbarrel（丙糖磷酸异构酶）。结构单元是turn-βstrand-turn-αhelix。构建的合成基因在E.coli中的表达的蛋白质结果：存在有序结构；原理：利用能识别序列内的多重位点的限制酶可以部分降解基因，并分离得到在单一位点被切断的线性片段。为了进行分散插入小的合成DNA片段，常常编码一个有限位点的片段（linker），可以把它配位到断开位置。为了建立分散删除，在重新配位形成之前用外核酸酶降解DNA，目的是快速扫描编码序列的长度以及鉴定重要功能区域，然后可进行单一氨基酸替换的更仔细的分析。扫描删除分析曾用于鉴定鼠和人的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的重要区域。GM-CSF的功能是刺激造血细胞的增殖。通过突变在5个氨基酸里删除3个，再在E.coli表达及检测活性。（三）利用蛋白质同源性鉴定功能残基同源蛋白质的保守的残基是保持那类蛋白质共同功能或是维持共同结构的关键因素。相反，在一类蛋白质内变化的残基看来对结构及功能不重要，但涉及在分子识别中起作用的专一性。这两个假设已用于指导位点突变分析蛋白质。缺点：不能确定效应有突变引起还是结构的微小变化引起。解决办法：减少结构的破坏。要求：预先尽可能多了解蛋白质的结构、进化保守及生物化学信息（X-射线、NMR结构信息，特别是蛋白质分子配体或底物形成的复合体的结构信息、原子水平上结构与活性的关系及分子相互作用等。）突变策略：已知结构并可进行序列对准的突变，使用不同二级结构单元的转换，如“loop-交换”。一组同源蛋白质同感兴趣的蛋白质比较，鉴定出高度保守的残基，它们是突变、功能进化的很好的候选残基；而非保守残基即涉及每个蛋白质的独特功能。如底物、专一性。优点：转换的序列与蛋白质的整体结构协调，突变对结构破坏少。四、天然蛋白质的剪裁分子剪裁：在天然蛋白质的改造中替换1个肽段或一个结构域。蛋白质结构对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能有一定的稳健度。不同的氨基酸序列具有相近的设计结构。第二节全新蛋白质设计一、引言反折叠研究：根据所希望的蛋白质结构及功能设计序列，从相反的方向了解决定蛋白质结构及功能的基本物理、化学规律及蛋白质折叠过程与步骤。全新蛋白质合成属于另一类蛋白质工程，它合成具有新奇的结构及功能的蛋白质。选择序列的方法：生物进化；全新蛋白质设计。全新蛋白质设计包括从头结构设计和从头功能设计。二、蛋白质结构的从头设计中心问题：设计一个具有稳定基独特的三维结构的序列。基本障碍：线性聚合链的构象熵。策略：（1）使相互作用的强度与数目达到最大。（2）通过共价交叉连接减小折叠的构象熵。根据第一原理设计一个蛋白质，我们必须依赖于分析已知结构的天然蛋白质中的二级结构单元，例如螺旋、β叠片、环以及转折，得到一些结构知识，这些知识涉及氨基酸形成二级结构的倾向性等。对于螺旋已有很好的认识，近来重点研究二级结构在三维空间形成的独特的构象通过长程相互作用可控形成超二级结构。螺旋合成、β折叠、ββα模块形成规律较清楚，设计合成成功率较高。复杂的三级折叠和四级结构可分解为有效的二级结构单元，如：螺旋、折叠、串、转角通过loop连接为三级结构。对蛋白质结构和稳定性很好的认识，在蛋白质设计中可