基因工程制药课件.pptVIP

二、反應器（發酵罐）設計符合生物反應與化學工程的需要設計前的生物數據：培養細胞系特性、細胞生長率、發酵罐消毒方法、溫度、溶氧、pH、CO2、代謝產物、後處理效果等設計要求：能連續發酵和分批發酵；附有加料管、取料管、測量儀錶；易安裝與移動；儀錶數據可靠，重現性好；可任意裝置附件；罐體為不銹鋼、光滑。三、發酵培養基組成提供化學元素：C、N、O、H、P、微量元素、金屬離子等提供特殊營養：氨基酸、維生素等提供能源：葡萄糖等控制代謝：加入活性物質、改變溫度和pH等四、工藝優化與參數監控優化工藝：週期短、產量高、品質好、消耗低、安全性高、廢物處理周全、速度快、失敗率低等綜合指標。監控數據：1）主要參數：pH、溫度、溶氧、CO22）生物量：濁度、細胞組分、總氮量、菌絲幹重3）碳源：糖、有機酸、乙醇、澱粉、脂質4）產品五、電腦的應用優化生產工藝降低勞動強度自動化第八節重組工程菌的培養基因工程菌的培養過程（1）搖瓶操作：瞭解工程菌生長的基礎條件（溫度、pH、培養基組分及C/N），分析表達產物的合成、積累對受體細胞的影響。（2）培養罐操作：確定培養參數、控制方案及順序。一、基因工程菌的培養方式（1）補料分批培養：將種子接入發酵反應器中進行培養，經過一段時間後，間歇或連續地補加新鮮培養基，使菌體進一步生長的培養方式。溶氧、流加補料（2）連續培養：將種子接入發酵反應器中，攪拌培養至一定濃度後，開動進料和出料的蠕動泵，以控制一定稀釋率進行不間斷的培養。兩階段連續培養，控制和優化誘導水準、稀釋率、細胞比生長速率。（3）透析培養：利用膜的半透性原理使代謝產物和培養基分離，通過去除培養液中的代謝產物來解除其生產菌的不利影響。（4）固定化培養：維持質粒穩定性（5）分批培養DO-Stat法：調節攪拌轉速和通氣速率控制溶氧在20%，補料的流加速率是關鍵。BalancedDO-Stat法：控制溶氧、攪拌轉速、糖的流加速率，使乙酸維持在低濃度。控制菌體比生長速率的方法：在最優表達水準獲得高密度、高表達。二、基因工程菌的培養工藝基因工程菌發酵工藝的影響因素（1）培養基的影響（C、N、無機鹽、維生素、微量元素等）常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白腖、酪蛋白水解產物、玉米漿和氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。另外還要加一些無機鹽、微量元素、維生素、生物素等。對營養缺陷型菌株還要補加相應的營養物質。第四節基因表達基因表達是指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程。基因表達研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下一個外源基因片斷，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產的表達產物。關鍵問題——建立最佳的基因表達體系（1）目的基因的表達產量（2）表達產物的穩定性（3）表達產物的生物學活性（4）表達產物的分離純化一、宿主細胞的選擇選擇宿主細胞的條件1）易獲得較高的濃度2）能利用易得價廉原料3）不致病、不產生內毒素4）發熱低、需氧少、發酵溫度/細胞形態適當5）易進行代謝調控6）易進行DNA重組技術操作7）產物的產量、產率高，易提取純化宿主細胞分類（1）原核細胞大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈黴菌等（2）真核細胞酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等[原核細胞]大腸桿菌***（1）高效、表達產物形式多樣、雜質多（2）胞內表達為主，提取困難（破碎細胞）（3）分泌不足，需在下遊經變性/複性處理（4）無修飾作用，不能糖基化，應用受限制（5）N-端含甲硫氨酸殘基，易致免疫反應（6）產生內毒素、蛋白酶等枯草芽孢桿菌（1）分泌能力強（2）不能糖基化（3）胞外蛋白酶強鏈黴菌（1）不致病、安全（2）分泌能力強（3）有糖基化能力（4）變鉛青鏈黴菌限制修飾能力弱（理想）[真核細胞]酵母（釀酒）***（1）基因組小、易調控、高效（2）繁殖迅速、價廉、無毒（3）分泌能力強（4）能糖基化絲狀真菌（1）種類多（＞30）、易得、安全（2）分泌能力強（3）能正確進行翻譯後加工（剪切/糖化）（4）糖化程度高哺乳動物細胞（1）能分泌、易調控、易純化（2）糖基化產物，接近天然（3）生產慢、產率低（4）培養條件苛刻、費用高二、大腸桿菌中的基因表達表達載體必須具備的條件（1）能獨立複製（嚴緊型/鬆弛型）（2）有靈活的克隆位點、篩選標記方便（3）啟動子強、易被RNA聚合酶識別（4）有阻遏子，控制啟動子在誘導時才轉錄（5）終止子強，主要轉錄克隆的外源基因（6）產生的