基因工程制药课件.pptVIP

**兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是對稱地圍繞著一個對稱軸排列，這種形式的斷裂結果形成具有粘性末端的DNA片段；

兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段。

**粘性末端(stickyends;cohensiveends)，是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構。它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環化起來。具平末端的DNA片段則不易於重新環化。限制酶都可以產生兩種粘性末端，一種是形成具有3′-OH單鏈延伸的粘性末端，另一種則是形成具有5′-P單鏈延伸的粘性末端，************Ⅲ型酶這類酶可識別特定堿基順序，並在這一順序的下游的24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點也是沒有特異性的。Eco57ICTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNN^GACTTCNNNNNNNNNNNNNN^**ⅡⅠⅢ酶分子內切酶與甲基化酶分子不在一起三亞基雙功能酶二亞基雙功能酶識別位點4-6bp,大多數為回文對稱結構二分非對稱5-7bp非對稱切割位點在識別位點中或靠近識別位點無特異性，至少在識別位點外1000bp在識別位點下游24-26bp各種限制與修飾系統的比較**限制性核酸內切酶的命名限制性核酸內切酶的命名原則：第一個字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母。其他字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數字：表示該菌株發現的限制酶的編號。例：EcoRI:來自於EscheriacoliRY13的第一個限制酶。**限制性核酸內切酶的命名屬名 種名 株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感桿菌d株HindIIId株中發現的第三個酶同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶**（三）II型限制性內切酶的基本特徵1.基本特徵1.識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列2.大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側3.識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點**？？II型限制性內切酶的基本特徵粘性末端平末端同裂酶同尾酶兩條鏈圍繞著一個對稱結構中心交錯地斷裂兩條鏈在一個對稱結構的中心上的斷裂識別相同靶序列的核酸內切酶產生相同的粘性末端的核酸內切酶**限制性內切酶在DNA克隆中的應用**gacggatcgggagaagcttcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgagctcagaatctggagctcaagctt**第二節基因工程的工具酶一、限制性核酸內切酶二、DNA連接酶三、DNA聚合酶四、核酸酶五、核酸修飾酶****ＤＮＡ連接酶能夠將DNA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。****連接酶的作用機理連接酶先與ATP作用，以共價鍵相連生成E-AMP中間體。中間體即與一個DNA片段的5‘-磷酸相連接形成E-AMP-5’-DNA。然後再與另一個DNA片段的3‘-OH末端作用，E和AMP脫下，兩個DNA片段以3’,5‘-磷酸二酯鍵相連接。此反應是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發的，需要花費兩個高能磷酸鍵。**DNA的腺苷酸複合物3’-OH對P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機理此反應是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發的需要花費兩個高能磷酸鍵（賴氨酸殘基）****1.大腸桿菌的DNA連接酶是一條分子量為75KD的多肽鏈。可以封閉雙螺旋DNA上具有5‘-磷醯基和3’-羥基的缺口（nick），不能封閉裂口（gap）；