转基因技术与作物育种.pptVIP

ampr(抗氨苄青霉素)、cmpr(抗氯霉素)、kanr(抗卡那霉素)、tetr(抗四环素)和strr(抗链霉素)等。1、根据载体选择标记基因筛选转化子抗菌素抗性基因和lacZ′基因目前常用的选择标记基因(1)抗菌素抗性基因和相应的选择药物筛选抗性基因第31页，共73页，星期日，2025年，2月5日把含目的基因的DNA片段插入其中之一选择标记基因区，导致该基因的插入失活。双抗选择标记载体第32页，共73页，星期日，2025年，2月5日epsps基因(2)载体除草剂抗性基因和相应的选择药物筛选抗草甘膦第33页，共73页，星期日，2025年，2月5日具完整乳糖操纵子的菌体能翻译β-半乳糖苷酶(Z)、透性酶(Y)和乙酰基转移酶(A)。当培养基中含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)时，可产生蓝色沉淀物，使菌落成蓝色。(3)乳糖操纵子lacZ基因筛选含乳糖操纵子缺陷型(lacZ)的载体转化互补型菌株，在含X-gal和IPTG的培养基中培养，克隆子是蓝色菌落，而未转化的互补型菌株的菌落是白色的。第34页，共73页，星期日，2025年，2月5日当含目的基因的DNA片段插入lacZ基因区，即使转化互补型菌株细胞，在含X-gal和IPTG的培养基中，也是长出白色的菌落。根据菌落的蓝、白颜色筛选出含目的基因的克隆子。由于互补菌株本身长成白色菌落的干扰，在构建载体时再组装一种供抗药性筛选的基因(ampr等)。第35页，共73页，星期日，2025年，2月5日(5)核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选(4)生长调节剂非依赖型筛选第36页，共73页，星期日，2025年，2月5日定义：其编码产物能够被快速地检测，用来判断外源DNA是否已导入到受体细胞并检测其表达活性的一类特殊的基因。1.表达产物及其功能在未转化的细胞内不存在2、利用报告基因筛选转化子报告基因(reportergene)报告基因必须具有两大特点2.便于检测通常在含目的基因的DNA片段与克隆载体连接之前，先在目的基因上游或下游连接一个报告基因。第37页，共73页，星期日，2025年，2月5日gus染色的棉花胚状体常用的报告基因*gus(β-葡萄糖酸酶)基因gus基因产物能够分解4-甲基伞形花酮-β-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮第38页，共73页，星期日，2025年，2月5日转基因烟草来自荧火虫的荧光素酶*luc(荧光素酶)基因荧光素+ATP腺苷酸荧光素酰化复合物LUC氧化脱羧氧化荧光素第39页，共73页，星期日，2025年，2月5日*gfp(绿色荧光蛋白)基因绿色荧光蛋白395nm荧光蛋白第40页，共73页，星期日，2025年，2月5日3、根据噬菌斑筛选重组DNA分子(目的基因+载体)必须达到野生型λDNA的75%~105%才能够进行体外包装。第41页，共73页，星期日，2025年，2月5日1、根据重组DNA分子大小鉴定(一)、根据重组DNA分子特征鉴定从克隆子提取DNA，经凝胶电泳检测。三、重组子的鉴定第42页，共73页，星期日，2025年，2月5日从克隆子提取DNA，用合适的限制性内切酶切，经凝胶电泳检测，若酶切片段数量和大小同原来用于转化的外源DNA被这些酶切割的结果一致。2、限制性内切酶分析第43页，共73页，星期日，2025年，2月5日根据含目的基因两端已知核苷酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的总DNA为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因。3、PCR分析优点：灵敏、快速，并且可证实是完整的目的基因第44页，共73页，星期日，2025年，2月5日杂交方法：斑点杂交、噬菌斑杂交4、分子杂交法DNA杂交P48：两个不同来源的单链DNA分子的核苷酸互补时，在复性条件可形成双链DNA。和DNA印迹(southernblotting)DNA杂交探针P48：指带有某种标记物的特异性核苷酸序列，能与该核苷酸序列互补的DNA进行退火杂交，并可根据标记物的性质进行有效的检测。杂交探针种类：32P、生物素、地高辛或荧光素第45页，共73页，星期日，2025年，2月5日提取待鉴定的转化子的总DNA，直接点样在分子杂交的膜上，用含目的基因DNA互补片段的探针与其杂交，若出现明显的杂交信号，可认为是真的克隆子。(1)斑点杂交法第46页，共73页，星期日，2025年，2月5