2026创新设计高考总复习生物（人教版）学生用-微专题15 RTPCR、反向PCR与PCR定点诱变技术.docxVIP

微专题15RT－PCR、反向PCR与PCR定点诱变技术

考情速览

热点

考情

RT－RCR、实时荧光定量、PCR与反向PCR

2022·全国乙卷，38；2022·江苏卷，24；2020·江苏卷，33；2020·山东卷，25

PCR定点诱变技术

2023·辽宁卷，25；2021·天津卷，16

热点1RT－PCR与反向PCR

(2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。

注：F1～F3，R1～R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。

(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是___________________________________________________________________

___________________________________________________________________。

提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是___________________________________________________________________

___________________________________________________________________。

(2)本操作中获取目的基因的方法是________和________。

(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是____________________________

___________________________________________________________________。

(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。

(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。

(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。

A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞

B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达

C.将1～1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列

D.用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白

情境素材反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。

(1)要扩增未知序列，应选择哪两种引物？

___________________________________________________________________

(2)上述PCR产物是环状DNA分子还是链状DNA分子？__________________

(3)上述PCR过程中使用了哪些酶？_________________________________

___________________________________________________________________

1.RT－PCR：即逆转录PCR，是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术。首先经逆转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段。

命题要点提醒：由于RNA不稳定，因此PCR不能直接扩增RNA；需要先将RNA逆转录得到cDNA，再进行PCR扩增。

2.反向PCR：反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间的DNA片段。

(1)原理

①酶切：选择已知序列内部没有切点的限制性内切核酸酶对该段DNA进行酶切；

②连接：用DNA连接酶使靶序列环化连接；

③扩增：用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外的未知序列。

(2)应用

通过反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。

命题要点提醒：

①选择限制酶时，要保证其在已知序列内部没有限制酶切割位点；

②选择引物时，要选择反向引物对(相对于已知序列)；若选择的是相向引物对，则扩增的是已知序列。

[例1](202