质粒种类与应用.pptVIP

考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒载体：pBluescript体外转录载体pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录提取出来的单链DNA重组分子在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录第94页，共138页，星期日，2025年，2月5日人们设计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体有多克隆位点、α-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。典型的这类质粒有pBluescriptⅡKS（±），这类质粒一般由4个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据多克隆位点两端KpnⅠ和SacⅠ的顺序，用KS或SK表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导DNA双链中不同链合成单链DNA，用+或-表示）。pBluescriptⅡKS（±）的多克隆位点与pUC18/19的不同，且使用f1噬菌体的复制与包装信号序列。?????????????第95页，共138页，星期日，2025年，2月5日人造染色体载体人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）第96页，共138页，星期日，2025年，2月5日人造染色体载体细菌人造染色体（BacterialArtificialChromosomesBAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（genecluster）结构构建动植物基因文库第97页，共138页，星期日，2025年，2月5日第62页，共138页，星期日，2025年，2月5日第63页，共138页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点第64页，共138页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记第65页，共138页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记imm434imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑第66页，共138页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑第67页，共138页，星期日，2025年，2月5日噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆