微生物人工合成途径防逃逸系统设计及应用研究.pdfVIP

摘要

进入21世纪以来，人工改造合成的微生物在可再生能源、临床治疗、工业

生产及环境保护等多个领域都产生了重要应用，而这些人工微生物在大规模应用

的同时也逐渐引起了社会对生物安全问题的思考。微生物系统中人工合成途径的

意外泄露可能会造成潜在的环境和健康问题，因此针对人工合成微生物体系设计

生物防逃逸系统成为一条重要解决途径。本课题以合成生物学研究中最常用的两

种微生物模式菌株——大肠杆菌和酿酒酵母作为底盘细胞，从两个思路进行了研

究，一是基于CRISPR系统设计靶向清除微生物中的人工合成途径，二是利用

TAG突变tRNA变体构建翻译水平正交化开关以实现对人工合成途径的开关控

制。

（1）为探究大肠杆菌中人工合成途径的防逃逸方法，采取清除外源代谢途

径的思路，基于CRISPR系统在大肠杆菌体内设计了三种靶向紫色杆菌素代谢途

pGM0-vioApGM0-vioBpGM0-vioE

径的基因线路，，和，他们分别靶向该代谢

途径的三个必需基因，结果表明，三种基因线路均可以实现百分百的清除效率，

其中pGM0-vioE的效果最为稳定。

2

（）为探究酿酒酵母中外源基因线路和合成染色体的防逃逸方法，采取和

大肠杆菌中类似的清除丢失靶向代谢途径的策略，证明了基于CRISPR系统的清

除基因线路在酵母中对于靶点基因的清除效率可以达到82%，也可以成功清除合

成型染色体上的靶向序列位点。

（3）基于翻译水平正交化控制原理，在酿酒酵母体内设计和表征了20种氨

基酸对应的TAG-tRNA变体在三种不同的启动子下对终止密码子的响应强度，

LysGluProIleTrpTyrHisCysLeuGlnGlyAsn

结果表明、、、、、、、、、、和这

12种氨基酸对应的tRNA变体的响应强度较高，并成功构建了仅能由tRNA变体

激活控制的正交胡萝卜素代谢途径。

综上，本课题基于CRISPR系统直接消除外源代谢途径的研究和设计tRNA

翻译水平正交化代谢途径的研究都取得了一定的防逃逸控制效果，对人工合成代

谢途径以及人工合成染色体的生物防逃逸研究具有重要意义。

关键词：生物防逃逸、生物安全、CRISPR-Cas9、密码子拓展、合成生物学

I

II

ABSTRACT

Sincethebeginningofthe21stcentury,artificiallymodifiedandsynthesized

microorganismshaveproducedimportantapplicationsinmanyfieldssuchas

renewableenergy,clinicaltreatment,industrialproduction,andenvironmental

protection.Thelarge-scaleapplicationoftheseartificialmicroorganismshas

graduallycausedthesocietytothinkaboutbiosafetyissues.Accidentalleakageof

syntheticpathwaysinmicrobialsystemsmaycausepotentialenvironmentaland

healthproblems,sothedesignofbiocontainmentsystemsforsyntheticmicrobial

systemshasbecomeanimportantsolution.Inthissubject,twomostusedmicrobial

modelstrainsinsyntheticbiologyresearch,EscherichiacoliandSaccharomyces

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