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2025年核酸检验面试题库及答案

一、核酸检验基础理论

1.请简述实时荧光定量PCR（qPCR）的基本原理及Ct值的临床意义。

实时荧光定量PCR基于DNA半保留复制原理，通过扩增过程中荧光信号的实时监测实现对靶核酸的定量分析。反应体系包括引物、探针、dNTP、Taq酶及待检核酸模板。扩增分为变性（95℃解链）、退火（引物与模板结合）、延伸（Taq酶催化dNTP聚合）三个阶段。荧光探针（如TaqMan探针）在延伸阶段被Taq酶切割，释放荧光基团，仪器通过检测荧光信号强度变化绘制扩增曲线。Ct值（循环阈值）指荧光信号达到设定阈值时的扩增循环数，与初始模板量呈对数负相关：模板量越多，Ct值越小。临床中，Ct值可用于判断样本中病原体载量（如新冠病毒），结合实验室设定的阳性阈值（通常为35-40），Ct值≤阈值为阳性，＞阈值需结合复检或其他指标综合判断。

2.反转录PCR（RT-PCR）与常规PCR的主要区别是什么？在核酸检测中如何选择应用？

RT-PCR与常规PCR的核心区别在于模板类型：常规PCR以DNA为模板，RT-PCR以RNA为模板。RT-PCR需先通过反转录酶（如M-MLV或AMV）将RNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增。应用场景上，RT-PCR主要用于检测RNA病毒（如新冠病毒、流感病毒）、细胞内mRNA表达水平等；常规PCR用于DNA病毒（如乙肝病毒）、细菌基因组、基因突变检测等。选择时需根据靶标核酸类型决定：若检测对象为RNA（如RNA病毒核酸），必须使用RT-PCR；若为DNA（如细菌16SrRNA基因、DNA病毒），则用常规PCR。

3.核酸扩增抑制物的常见类型及消除方法有哪些？

常见抑制物包括：（1）样本基质成分：全血中的血红蛋白、免疫球蛋白；组织中的胆红素、多糖；粪便中的胆盐、尿素；（2）化学物质：EDTA（过量影响Mg2+浓度）、乙醇（提取残留）、次氯酸盐（消毒残留）；（3）生物成分：蛋白酶、核酸酶（未彻底灭活时破坏模板）。消除方法：（1）优化样本前处理：如全血样本使用含蛋白酶K的裂解液充分消化，粪便样本增加离心洗涤步骤减少杂质；（2）调整反应体系：增加Mg2+浓度（中和负电荷抑制物）、使用BSA（结合抑制物）；（3）选择抗抑制性强的酶：如热启动Taq酶或经改造的高保真酶；（4）稀释样本：若抑制物浓度过高，可将提取的核酸适度稀释后检测（需注意稀释可能降低灵敏度）。

二、实验室操作技能

4.请详细描述新冠病毒核酸检测的全流程（从样本接收至报告发放）。

（1）样本接收与登记：核对样本信息（姓名、编号、采集时间），检查容器密封性、样本类型（咽拭子/鼻拭子/肺泡灌洗液）及保存条件（2-8℃或-20℃），记录异常情况（如漏液、标签模糊）并反馈。

（2）样本前处理（生物安全柜内操作）：

-灭活：56℃孵育30分钟（或按试剂说明书），破坏病毒结构同时保留核酸完整性；

-核酸提取：使用磁珠法或柱提法。以磁珠法为例：加入裂解液（含异硫氰酸胍破坏蛋白）、磁珠（吸附核酸），经洗涤（75%乙醇去除杂质）、洗脱（TE缓冲液或纯水释放核酸）得到纯化产物；

-质量初筛：通过紫外分光光度计检测A260/A280（1.8-2.0为合格），或肉眼观察洗脱液是否澄清（浑浊提示蛋白残留）。

（3）体系配制与加样：

-试剂准备：从-20℃取出扩增试剂，室温平衡15分钟，涡旋离心后分装；

-加样：在样本制备区将提取的核酸加入反应管（每管10-20μL），同时设置阴性质控（无核酸水）、阳性质控（已知阳性标准品）、内标（监测提取及扩增效率）；

-密封与转移：反应管离心去气泡，转移至扩增区。

（4）扩增检测：

-仪器参数设置：变性95℃3分钟，循环40次（95℃15秒，60℃30秒），采集荧光信号（FAM通道检测ORF1ab基因，HEX/VIC检测N基因）；

-运行监控：观察扩增曲线是否符合预期（S型），避免仪器中途断电或温度异常。

（5）结果分析与审核：

-判读规则：内标Ct值≤35（有效扩增），阴性质控无扩增或Ct＞40，阳性质控Ct≤30；

-样本结果：双靶标Ct≤35为阳性，单靶标阳性需复检，双靶标无扩增或Ct＞40为阴性；

-报告生成：记录检测时间、仪器编号、操作人员，审核人确认后签发电子/纸质报告。

5.核酸提取过程中如何避免交叉污染？请列举3项关键措施。

（1）分区操作：严格遵循PCR实验室“四区”要求（试剂准备区→样本处理区→扩增区→产物分析区），各区物品专用（移液器、离心管、手套），不得交叉使用。

（2）防气溶胶措施：

-使用带滤芯的吸头（阻止液体倒吸入移液器）；

-样本处理时