基因工程核酸的提取与纯化.pptVIP

3噬菌体DNA的制备噬菌体DNA的纯化，与前面的关键区别在于：对噬菌体DNA来说，初始材料不是细胞提取物。因为噬菌体颗粒能够从被侵染细菌的细胞外培养基中大量获得。当这样的培养物被离心时，细菌聚集成小球沉淀在离心管的底部，把噬菌体颗粒留在了悬液中(图3-16)。噬菌体颗粒接着被从悬液中收集起来。噬菌体DNA需要经过一个去除蛋白的步骤以除去蛋白衣壳后才能够得到。第59页，共93页，星期日，2025年，2月5日第60页，共93页，星期日，2025年，2月5日成功纯化大量的噬菌体DNA却要受到一些缺陷的影响。对于λ噬菌体来说，虽然细胞外的噬菌体浓度(每毫升培养物含有噬菌体颗粒的数量)已经足够高（λ噬菌体合理的噬菌体浓度为1×1010个/ml），但只能产生500ng的DNA。因此如果要获得足够量λDNA，需要500-1000mL的大体积培养。第61页，共93页，星期日，2025年，2月5日3.1培育培养物以获得高的λ密度大体积培养物的生长不存在任何问题(50L和50L以上体积的细菌培养在生化技术上是很常见的)，但是获得最大噬菌体浓度需要一定的技巧。天然的λ噬菌体是溶源性的，被侵染培养物主要是由含有已经整合到细菌染色体的前噬菌体的细胞所组成(图2-7)。在这种环境下，细胞外的λ噬菌体浓度非常低。第62页，共93页，星期日，2025年，2月5日第63页，共93页，星期日，2025年，2月5日为了得到高产量的细胞外λ噬菌体，培养物必须被诱导，以使所有细菌进入侵染循环中的溶解阶段，导致细胞死亡并将λ噬菌体颗粒释放到培养基中。诱导过程通常是很难控制的，但是绝大多数实验用λ噬菌体的cI基因含有温度敏感突变.。cI是将噬菌体DNA保持在整合状态所需要依赖的基因。如果该基因突变失活，则cI基因就不能够再正常发挥作用并引起细胞溶解的发生。第64页，共93页，星期日，2025年，2月5日在cI温度敏感突变中，cI基因在30℃时发挥作用，正常的溶源性能够发生。在42℃时，cI温度敏感突变基因就不能够再正常工作，溶源性也就不能够继续保持。因此，被携带cI温度敏感突变的λ噬菌体侵染的大肠杆菌培养物，在从培养温度30℃提高到42℃时，就能够被诱导产生细胞外噬菌体。第65页，共93页，星期日，2025年，2月5日第66页，共93页，星期日，2025年，2月5日对于浓的DNA溶液，乙醇能够在样品的上方形成一个分层，使得核酸分子在两相界面处沉淀出来。一个技巧：将一根玻璃棒穿过乙醇层伸入核酸溶液中。当棒子被取出的时候，DNA分子就会呈纤维状黏附在棒上面而从溶液中取出。当乙醇和DNA溶液混合时，DNA沉淀能够通过离心得到，并随后能溶解在合适量的水中。第27页，共93页，星期日，2025年，2月5日第28页，共93页，星期日，2025年，2月5日1.5DNA浓度的测量在实施基因克隆实验时，确切知道溶液中的DNA含量是十分关键的。DNA浓度能够通过紫外吸收分光光度测定法进行测定。被DNA溶液吸收的紫外线的量能够直接正比于样品溶液中的DNA含量。通常吸收量在260nm被测定，1.0的吸收值对应于每毫升中50g双链DNA。第29页，共93页，星期日，2025年，2月5日紫外吸收还被用来检测DNA的纯度。纯净的DNA样品，在波长260nm和280nm的吸收量之比(A260／A280)应为1.8。如果实际测量时比例小于1.8，表示样品被蛋白质或苯酚污染。第30页，共93页，星期日，2025年，2月5日1.6从细菌外的生物体制备全细胞DNA尽管各种来源细胞DNA的纯化基本步骤不变，但要考虑所用细胞的一些特性，并对实验步骤加以调整。主要的调整发生在细胞破碎阶段。破碎细菌时所使用的化学药物对其他生物细胞并不总是适用。比如，溶菌酶对植物细胞就毫无作用。专一性的降解酶对绝大多数的细胞壁都适用，通常一些物理方法，如用研钵对冷冻材料研磨更有效。绝大多数动物细胞仅用去垢剂处理就能够去掉外被。第31页，共93页，星期日，2025年，2月5日需要着重考虑：需要提取DNA的细胞的生化成分。细菌：主要的细胞提取物是蛋白质、DNA和RNA。苯酚提取或蛋白酶降解，核糖核酸酶分解RNA，就能得到纯净的DNA样品。如果细胞中还包含大量的其他生化成分，这些处理就显得不足以制得纯净的DNA。植物组织的处理尤其困难，因为它们经常含有大量的碳水化合物，这些碳水化合物不能够通过苯酚提取而除去，所以需要使用一些不同的方法。第32页，共93页，星期日，2025年，2月5日染色体细菌