嗜碱碱性卤杆菌蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的分泌优化及改造.pdfVIP

摘要

碱性蛋白酶是一种重要的工业酶，广泛应用于食品、医药等多个行业，其市

场前景非常可观。目前，枯草芽孢杆菌是工业中最常见的胞外碱性蛋白酶表达宿

主，具有分泌能力强且具有蛋白酶耐受性、不含外毒素和内毒素、生长周期短等

许多优点。本研究利用基因工程的方法，使用枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis

WB600为宿主表达来源于嗜碱碱性卤杆菌Alkalihalobacillusalcalophilus的蛋白

酶基因，通过蛋白质结构理性设计、信号肽筛选、启动子串联及培养条件探索优

化提高了碱性蛋白酶的表达量及稳定性。具体研究内容如下：

1A.alcalophilus

（）碱性蛋白酶的异源表达。通过文献查找，选择来源于

aprGenBankNo.ACR24262.1pBE-S

的蛋白酶基因序列alc（），连接至穿梭载体

B.subtilisWB600LB

上，并通过高渗透压法电转至进行异源表达。使用液体培

养基发酵，纯化后测定蛋白酶Apr的基本酶学性质。测定结果表明，野生型

alc

Apr的最适反应pH为11，在pH为12的条件下孵育1h后，酶活力依然能保

alc

留原来的40%左右；野生型Apr的最适反应温度为50℃，当酶液在温度为

alc

20℃-45℃的条件下孵育1h后，酶活力几乎能保留100%，具有较好的嗜碱性

和耐温性。

（2）信号肽和启动子的优化。通过In-Fusion无缝克隆获得含有173种枯草

芽孢杆菌内源性信号肽的质粒文库，电转至B.subtilisWB600后，通过牛奶固体

培养基对比水解圈大小与菌落大小的比值进行初筛，通过对比酶活力大小的方法

进行复筛，挑选出最佳信号肽SPYdjm，使酶活达到约1000U/mL，是野生型菌株

酶活的14倍左右；在此基础上，同样通过In-Fusion无缝克隆构建了包含六种不

同双元启动子（P-P、P-P、P-P、P-P、P43-P、P-P）

BsamyBamyHapIIylbspoVGaprEBamyaprEaprEylbaprE

的质粒，对比其对产酶的影响，启动子P-P实现了酶活分泌最大化，最大

HapIIylb

酶活达到约1800U/mL，使酶活进一步提高80%左右。

（3）碱性蛋白酶突变体的设计与酶学性质检测。在野生型Apr的基础上，

alc

通过提高蛋白质折叠效率、骨架刚性、表面电荷性质并通过分子动力模拟筛选催

AprP1AprP2

化反应焓变较低的蛋白突变体的原理设计了三种结构突变（alc、alc、

AprP3AprpH

alc）。与野生型蛋白酶alc相比，三种突变体的温度稳定性和稳定性

均有不同程度的提升，且突变体AprP1的最适反应温度由50℃提高至65℃，

alc

70℃时突变体AprP1的酶活较野生型约提升了13%，对高温的耐受性提高使