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基于ISSR标记的麻疯树遗传多样性解析及育种启示

一、引言

（一）麻疯树的研究价值与遗传多样性需求

麻疯树（JatrophacurcasL.），作为大戟科麻疯树属的一员，是一种兼具能源与药用价值的多功能植物，又名小桐子、青桐木、假花生、臭油桐，主要分布于热带和亚热带地区，在我国的热带地区及干热河谷广泛种植。其种子含油量颇高，高达30%-60%，是提炼生物柴油的优质原料，在全球对清洁能源需求日益增长的背景下，麻疯树生物柴油成为化石燃料的理想替代品，助力各国实现能源转型和碳中和目标。除了在能源领域的突出表现，麻疯树在药用方面也不容小觑。其种子具有清热解毒、消肿散淤的功效，近年来的研究还发现它具有显著的抗癌活性，在工业用油、生物病虫害防治、新药开发等方面同样具有潜在的应用价值。

在自然环境中，麻疯树种群存在着一定程度的遗传分化，不同地理区域的种群在基因组成上有所差异。而人工选育过程虽然旨在获得更优良的品种，但也可能导致遗传瓶颈，使得某些优良基因的丢失或遗传多样性的降低。这些因素都对麻疯树的品种改良形成了阻碍，限制了其在能源和药用领域的进一步发展。因此，深入研究麻疯树的遗传多样性，对于解析其进化潜力、优化育种策略具有重要意义，是推动麻疯树产业可持续发展的核心基础。

（二）ISSR技术的优势与应用背景

ISSR（简单序列重复区间标记）技术，由Zietkeiwitcz等于1994年提出，是一种基于微卫星基础上的分子标记技术。其原理是在真核生物基因组中普遍存在的SSR5’或3’末端锚定2-4个随机核苷酸作为引物，以SSR间具有反向排列的一段序列进行扩增。这种技术具有诸多显著优势，操作简便，实验流程主要包括模板DNA提取、PCR扩增、电泳检测等，实验周期较短，适用于大规模样本分析；多态性高，能够有效揭示个体间的遗传差异，多态性比率通常在70%以上，为遗传多样性研究提供丰富的信息；成本较低，实验材料、试剂和设备需求相对较少，在资源有限的研究机构和实验室中也能广泛应用。

ISSR技术已在多个物种的遗传多样性研究中得到成功应用。在山茱萸的研究中，通过ISSR标记分析，揭示了不同山茱萸种群之间的遗传关系和遗传多样性水平，为山茱萸的资源保护和品种选育提供了科学依据。在食用菌的研究中，ISSR技术帮助科研人员了解了食用菌的遗传结构和进化关系，有助于优良菌株的筛选和培育。将ISSR技术应用于麻疯树的遗传多样性研究，能够高效地解析麻疯树种质资源的遗传变异，为麻疯树的资源保护、分子育种以及品种改良提供有力的技术支撑，具有重要的应用前景。

二、材料与方法

（一）实验材料收集与预处理

1.种质资源取样

本研究的样本采集工作广泛涵盖了我国麻疯树的主要分布区域，包括云南、四川、广西、贵州、海南等5个主产区。这些地区的气候条件、土壤类型和海拔高度差异较大，为麻疯树的生长提供了多样化的生态环境。在每个主产区，根据当地的地形地貌和麻疯树的自然分布情况，精心选择了9个自然居群，共计采集了135份样本。这些样本中既包含了在自然环境中生长的野生型麻疯树，也涵盖了经过人工培育的栽培品系。例如，在云南元谋干热河谷地区，野生麻疯树在恶劣的生态条件下展现出独特的适应性特征；而在四川攀枝花的人工种植园中，栽培品系则体现了人工选育对麻疯树性状的改良效果。通过这样广泛而有针对性的取样，确保了样本在地理分布和生态型上具有充分的代表性，能够全面反映麻疯树种质资源的遗传多样性。

2.DNA提取与质量检测

采用改良CTAB法对采集的麻疯树叶片进行基因组DNA提取。在液氮的低温环境下，将叶片研磨成粉末，以充分破碎细胞。加入预热的CTAB提取缓冲液，其中含有抗氧化剂和强还原剂，有效抑制了细胞匀浆中氧化酶类对DNA的降解作用。CTAB作为一种阳离子去污剂，能够溶解细胞膜并与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中保持可溶状态，通过氯仿-异戊醇抽提，有效去除了蛋白、多糖、酚类等杂质，随后加入乙醇沉淀，成功分离出纯净的DNA。

提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察到清晰的条带，表明DNA完整性良好，无明显降解。利用紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度，通过分析OD???/OD???的比值来评估DNA的质量。筛选出OD???/OD???在1.8-2.0区间的DNA样本作为高质量模板，用于后续的ISSR-PCR分析。此区间的比值表明DNA样本中蛋白质、酚类等杂质含量极低，能够满足实验对DNA质量的严格要求。

（二）ISSR-PCR体系优化与引物筛选

1.反应体系构建

通过正交试验对ISSR-PCR反应体系中的关键参数进行了系统优