第六章 高通量筛选技术.pptVIP

报告基因实验分子生物学家和细胞生物学家利用报告基因研究基因的表达和调控。将报告基因引入细胞DNA使之与某一特定分子事件相关，可以为这一分子事件带来可测性。通常检测的分子事件是基因功能，具有可测性的是发光。目前，市场上有许多发光报告基因出售。包括：萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase），β－半乳糖苷酶（B-galactosidase），β－葡萄糖苷酸酶（B-glucuronidase，GUS），碱性磷酸酶（alkalinephosphatase），和人生长激素（humangrowthhormone，hGH）。高灵敏度，低成本，快速以及使用简单使得发光检测仪成为理想的基因表达研究工具。第27页，共42页，星期日，2025年，2月5日ATP水平测定所有活细胞都含有ATP。ATP可以从细胞中提取出来，用萤火虫荧光素酶检测。在这个发光反应中，ATP是限制性反应物。因此，到达发光检测仪光电倍增管的光与样品中ATP的含量成比例，相应的与提取ATP所用的细胞数成比例。ATP发光检测方法已经使用了几十年。第28页，共42页，星期日，2025年，2月5日微生物污染检测ATP的发光检测方法可以检测样品中的所有微生物，因而被用于检测水中的大肠杆菌含量，包括饮用水和用于oilfieldinjection，coolingsystem以及纸加工过程的工业用水。ATP的发光检测方法还可以用于药品，化妆品，牛奶以及其它食品的微生物控制。第29页，共42页，星期日，2025年，2月5日三、高通量筛选的技术过程1、样品库2、初筛和复筛3、活性化合物4、深入筛选5、获得少量先导化合物6、确证筛选药物药理学研究7、侯选药物8、临床前研究第30页，共42页，星期日，2025年，2月5日第1页，共42页，星期日，2025年，2月5日高通量筛选最初是伴随组合化学而产生的一种药物筛选方式。1990年末，组合化学的出现改变了人类获取新化合物的方式，人们可以通过较少的步骤、在短时间内同时合成大量化合物，在这样的背景下高通量筛选的技术应运而生。高通量筛选技术可以在短时间内对大量候选化合物完成筛选，经过近十年的发展，已经成为比较成熟的技术，不仅仅应用于对组合化学库的化合物筛选，还更多地应用于对现有化合物库的筛选。目前世界各大药物生产商都建立有自己的化合物库和高通量筛选机构，对有潜力形成药物的化合物进行篦梳式的筛选。第2页，共42页，星期日，2025年，2月5日我国药物高通量筛选起步较晚，且不规范，仅有十多年的研究历史。1996年中国医学科学院引进国内第一台Bionek2000型实验自动化工作站；1998年又引进全国第一台Topcount微量闪烁计数器，使放射配基实验、放射免疫实验等技术微量化、自动化。上海药物研究所、北京军事医学科学院分别成立了药物筛选专门机构，开始从事大规模筛选工作。西安交通大学药学院贺浪冲教授首创的细胞膜色谱（CMC）为化合物的体外高通量筛选提供了高选择性、高特异性、高效率的筛选手段。CMC已成功用于钙离子拮抗剂受体配体结合反应的研究，目前正在进行心血管化学合成药物的高通量筛选和中药有效部位及有效成分的寻找。今年将建立CMC自动化筛选体系，促进我国药物高通量筛选技术的全面发展。第3页，共42页，星期日，2025年，2月5日概念高通量筛选(Highthroughputscreening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体运转的技术体系。第4页，共42页，星期日，2025年，2月5日高通量细胞筛选技术(high-throughputcell-basedscreeningtechnology)是以高通量方式研究基因功能最有效的方法之一。通常,基因功能的初步筛选在96孔或384孔板上进行,通过基因转染将候选基因导入细胞,或直接将基因表达产物加入细胞培养液中。是20世纪80年代后期发展起来的一种筛选新技术。它集计算机控制、自动化操作、