第五章基因的克隆与分离.pptVIP

5’RACE在第一链cDNA的3’端加上人工锚定序列用oligo（dT）引发合成cDNA第一链利用5’锚定引物及3’特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列第31页，共49页，星期日，2025年，2月5日二、基因组文库的构建与基因分离基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。（一）基因组文库（genomiclibrary）（二）基因组文库应满足的条件1、文库的完整性2、基因组信息的可重建性3、文库的大小第32页，共49页，星期日，2025年，2月5日（三）基因组文库构建的一般步骤1、染色体DNA的分离2、大片段的制备3、载体的制备4、重组连接5、包装6、重组噬菌体

感染大肠杆菌基因组文库第33页，共49页，星期日，2025年，2月5日（四）基因组文库的筛选筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来探针筛选法：

两步或三步原位杂交法第34页，共49页，星期日，2025年，2月5日（一）cDNAlibrary将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。三、cDNA文库的构建与筛选（二）cDNA文库应满足的条件1、文库的代表性2、序列的完整性第35页，共49页，星期日，2025年，2月5日（三）构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取（2）mRNA的分离纯化（3）cDNA的合成（4）cDNA与载体连接（5）重组载体转化受体菌第36页，共49页，星期日，2025年，2月5日①基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。②基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。③基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。Genomiclibrary与cDNAlibrary区别第37页，共49页，星期日，2025年，2月5日第四节基因差异表达获得目的基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，称为基因的差异表达。真核基因总数约为100000个，但在一定的发育阶段、在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达，产生出大约15000种不同的mRNA分子。一、差异显示PCR（DDRT-PCR）DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术第38页，共49页，星期日，2025年，2月5日（1）3’锚定引物Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’3’利用mRNA的polyA尾巴设计利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增第39页，共49页，星期日，2025年，2月5日第五章基因的克隆与分离第1页，共49页，星期日，2025年，2月5日第五章基因的克隆与分离第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA第二节基因组文库的构建与基因分离第三节cDNA文库的构建与筛选第四节根据差异表达获得目的基因第五节基因的化学合成第2页，共49页，星期日，2025年，2月5日一、cDNA末端的快速扩增（RACE）RACE：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3‘端和5’端进行克隆，可获得全的cDNA克隆。（RACE克隆的意义）第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA第3页，共49页，星期日，2025年，2月5日1、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列，测序。2、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的3’端和5’端的扩增。3、拼接成cDNA全序列的信息，设计新的引物扩增全长cDNA序列。第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA一、cDNA末端的快速扩增（RACE）第4页，共49页，星期日，2025年，2月5日（二）经典RACE克隆原理：3’RACE：由含有oligo（dT）的接头