第十章酶的定向进化讲课文档.pptVIP

第十章酶的定向进化;一、自然进化与定向进化;2、定向进化;3、定向进化的一般过程;4、酶定向进化的意义;二、理论来源;是蛋白质工程的新策略

主要是利用分子生物学手段，在分子水平创造分子的多样性，在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。

是一种在生物体体外快速模拟达尔文进化的、具有一定目的性和快速改造蛋白质的方法，相对于传统的蛋白质的“理性设计”，酶的分子定向进化属于蛋白质的非合理设计。;定向进化的过程;20世纪60年代利用RNA噬菌体进行实验，是第一次在分子水平上定向改造单一分子。;1981年，B.G.Hall等定向改变E.coliK12中ebg酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。

1993年，Arnold研究组提出易错PCR的方法。

1994年，Stemmer将DNA重组方法引用到酶分子的定向进化中。

1999年，Stemmer等把DNA改组延伸到族改组。;

第三节定向进化的选择策略

;1、易错PCR(error-pronePCR);连续易错PCR(Sequentialerror-pronePCR);2、DNA改组;DNA改组是DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。是一种分子水平上的定向进化。因此也称为分子育种。

DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此，灵敏可靠的筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。

;DNA改组原理;DNA改组步骤：

（1）目的DNA片段的获得；

（2）目的基因的随机片段化，即将目的基因（可以是单个基因或一组相关基因）酶切成随机片段，这些随机片段集合包含了来自不同的同源序列的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同的3’末端；

（3）无引物PCR，具有互补3’末端的寡核苷酸互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环，在不同模板上随机互补进一步延伸；

（4）有引物PCR，以上轮无引物PCR的产物为模板，加入基因两端序列为引物，经过多轮PCR得到重排产物的集合为突变文库；

（5）克隆、筛选、分析及多轮筛选，即进一步对突??文库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮改组的模板，重复上述步骤进行多次重排和筛选，最终获得性状比较理想的突变体。;单

个

DNA

改

组

技

术

原

理

示

意

图;（b)基因家族改组技术(familyshuffling);;与常规突变技术相比，DNA改组有以下显著优点：

①DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb；

②通过多轮筛选或选择，可使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；

③DNA改组从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序；

④DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率。研究表明，DNA改组比随机突变具有较大的优势，随机突变的方法一般产生1%的良性突变，但DNA改组可产生13%的良性突变。;DNA改组与常规定向进化的比较;3、体外随机引发重组法

(random-priminginvitrorecombination,RPR);该法优于DNA改组法的特点在于:;4、交错延伸;第四节定向进化的应用;一、提高酶分子的催化活力;二、提高酶分子的稳定性;2、pH稳定性

不同的酶有其不同的最适pH范围，当反应体系的pH值达到其最适条件时，酶将发挥其最佳的催化效率，但当反应体系的pH不适宜时，酶的催化效率就会有所降低，在极端的pH条件下，甚至会失去活性。

3、非水相的稳定性

有机化学合成中酶的开发与应用越来越引起人们的重视，酶在非水相中的催化反应在各领域得到了广泛应用，已成为酶学研究的主要内容之一。;谢谢大家！