大葱中参与类黄酮合成的2-ODD家族基因功能的研究.pdfVIP

中文摘要

大葱，百合科葱属的草本植物，常作为一种很普遍的香料调味品或蔬菜

食用，同时对人的身体健康有着很好的保健作用。黄酮类化合物属于次生代谢

产物，可以保护植物免受生物和非生物胁迫的功能，调节植物生长发育过程

中的表型等，在人体中可以预防心血管疾病，具有药用价值。2-ODD基因家

族是植物基因组中的第二大酶家族,在类黄酮次级代谢合成途径中起着重要作用。

大葱主要的次级代谢物为类黄酮，而大葱2-ODD基因家族和类黄酮有关的合

成途径的相关研究较少。本研究以大葱为材料，对大葱中参与类黄酮合成的2-

ODD家族基因功能进行研究，从大葱中克隆出关键基因F3H；使用在线软件

分析了大葱的F3H、FLS和ANS基因的基本信息；随后对大葱中的F3H、FLS

和ANS基因在不同组织中的表达进行了定量，同时也测定了这些组织中类黄酮

的含量；利用原核表达系统诱导纯化了大葱F3H、FLS和ANS基因编码蛋白，

并用不同的底物对其活性进行了鉴定；将大葱F3H基因过表达于烟草中，观察

其引发的相关表型变化，并用HPLC分析了转基因烟草中的类黄酮与花青素含

量；最后在DFR突变体拟南芥tt3中过表达大葱ANS基因，并进行了相关分析。

具体结果如下：

(1)从大葱中克隆了类黄酮合成途径中的关键酶基因F3H，命名为AfF3H。

AfF3H的编码区全长为1104bp,编码367个氨基酸；利用生物信息学分析了

AfF3H、AfFLS和AfANS基因；

(2)使用qRT-PCR分析了大葱不同组织中类黄酮生物合成相关基因AfF3H、

AfFLS和AfANS的表达量及类黄酮的含量。结果显示：AfF3H基因在花中的表达

量远高于根等其他组织，而在叶片中几乎没有表达；AfFLS基因在叶片中表达

量最高，在根中最低；AfANS基因在花中表达量最高，根中几乎没有表达；类

黄酮化合物的含量在叶中最高，花中含量最低。

(3)分别构建pET15b-AfF3H、pET15b-AfFLS和pET15b-AfANS重组蛋白原

核表达载体，并通过IPTG进行蛋白诱导纯化，纯化后通过加入不同的底物进

行体外蛋白酶活测试，高效液相色谱(HPLC)方法结果显示：外源表达的

AfF3H对山奈酚和柚皮素均具有催化活性，AfFLS对二氢山奈酚和二氢槲皮素

也均具有催化活性；

(4)成功构建LC-AfF3H过表达载体，利用农杆菌介导的叶转盘法转化烟草，

获得过表达株系，与野生型相比，AfF3H转基因烟草叶片颜色加深，烟草花瓣

颜色也有不同程度的加深。利用qRT-PCR方法分析显示：转基因植株中AfF3H、

AfFLS和AfANS基因表达量相对野生型均显著性增加。高效液相色谱(HPLC)方

法分析表明：转基因植株中类黄酮的含量也均有所增加。这些结果进一步说明

AfF3H基因在类黄酮生物合成途径及花青素合成途径中发挥重要作用；

(5)成功构建LC-AfANS植物表达载体，通过蘸花法转化DFR突变体拟南芥

tt3，筛选出T3代后，发现T3代转基因拟南芥存在表型，一种根系短且有多

个侧根；另一种根系长且无侧根。高效液相色谱(HPLC)方法分析表明：两种转

基因拟南芥植株中花青素含量均有所增加，但类黄酮的含量变化有所不同：第

一种除槲皮素含量有所增加以外，其他类黄酮含量均无明显变化，而第二种二

氢槲皮素、二氢山奈酚、槲皮素和山奈酚含量均有所增加。结果表明AfANS不

仅是花青素合成途径的关键基因，同时也能够参与类黄酮的合成。

关键词：大葱(AlliumfistulosumL.)；2-ODD；基因克隆；功能验证

Abstract

Greenonions,herbaceousplantsofthefamilyLiliaceae,areofteneatenasavery

commonspicecondimentorvegetable,andhaveagoodhealthcareeffect