第八章 蛋白表达系.pptVIP

2.常用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统（2）甲醇营养型酵母表达系统?（3）裂殖酵母(Schizogenesispombe)表达系统第30页，共48页，星期日，2025年，2月5日（1）酿酒酵母表达系统酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。第31页，共48页，星期日，2025年，2月5日自主复制型质粒自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列(automaticreplicatingsequence，ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制，这些质粒往往不稳定。第32页，共48页，星期日，2025年，2月5日整合型质粒不含ARS整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2(formultipleintegrationintoribosomalDNinyeast)质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。第33页，共48页，星期日，2025年，2月5日酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。第34页，共48页，星期日，2025年，2月5日第1页，共48页，星期日，2025年，2月5日基因工程意味着重要的植物或动物蛋白基因可以从宿主中分离出来，插入载体，“carriers”将运载外源基因到宿主细胞中，然后被转化成蛋白。经过许多年的发展，蛋白生产能力的提高已经在进一步理解基因的功能和所编码蛋白的功用和相互作用等方面起到了积极作用。第2页，共48页，星期日，2025年，2月5日8.1大肠杆菌中表达系统如果将外源基因插入标准的克隆载体，不可能合成重组蛋白，因为基因的表达依赖于基因周围的一组信号，这些信号必须能被细菌识别。这些信号都是一些短的核苷酸序列，为转录和翻译提供信号：第3页，共48页，星期日，2025年，2月5日8.1.1外源基因在大肠杆菌中

高效表达的原理第4页，共48页，星期日，2025年，2月5日三个最重要的信号：1）promoter:是转录起始信号，在E.coli中，启动子必须能被RNA聚合酶的sigma亚基所识别。2）Teminator：转录结束的位点，终止子一般是可以自我配对形成stem-loop的核苷酸序列。3）核糖体结合位点：能被核糖体识别的位点，转录成mRNA分子后，核糖体在这一位点上结合。第5页，共48页，星期日，2025年，2月5日图8-1基因表达的信号第6页，共48页，星期日，2025年，2月5日1.启动子启动子是表达载体的最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。获得重组蛋白的数量很大程度上取决于表达载体所携带的启动子。第7页，共48页，星期日，2025年，2月5日第8页，共48页，星期日，2025年，2月5日几种使用频率最高的启动子：1)lac启动子：控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。2)trp启动子：色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被3-β-吲哚丙烯酸诱导。

第9页，共48页，星期日，2025年，2月5日几种使用频率最高的启动子：3)tac启动子：是lac和trp启动子的杂交分子，比两者都要强，同样可以被IPTG所诱导。4)λPL启动子：是负责λDNA分子转录的启动子之一。第10页，共48页，星期日，2025年，2月5日2.终止子外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。第11页，共48页，星期日，2025年，2月5日目前外源基因表达质粒中常用的终止子来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2T7噬菌体DNA上的Tφ第12页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）第13页，