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RT-qPCR实验全流程以及案例演示

目录实验流程以及注意事项010302荧光定量PCR结果评定指标数据分析以及实际案例

实验流程以及注意事项01

实验流程以及注意事项RNA的制备cDNA的制备引物设计PCR实验RNA质量问题浓度与纯度评估：紫外分光光度计或者nanodrop测定目标比值是否存在A260/2301.8有机化合物，糖，尿素，盐A260/2801.8蛋白质残留A260/2802.1可能降解RNA完整性评估高质量RNA三条比较明显的条带，分别为18S/28S/5S，而且28S与18S的条带亮度之比大体2:1基因组DNA残留泳道上部有明显的高分子量条带蛋白残留会在点样孔中观察到比较亮的着色成分

实验流程以及注意事项RNA的制备cDNA的制备引物设计PCR实验RNA质量问题RNA产物中是否存在相关抑制物？--抑制后续反转录反应，导致无cDNA生成或者定量结果奇怪。RNA是否发生降解--用安捷伦2100测定RNA的RIN值，其中RIN7为高质量，6-7勉强可用，6为较差质量。RNA中是否有gDNA的残留？---如何去除？选用具有去基因组功能的RNA提取试剂或者逆转录试剂，或者跨内含子设计引物。

实验流程以及注意事项RNA的制备cDNA的制备引物设计PCR实验

实验流程以及注意事项RNA的制备cDNA的制备引物设计PCR实验用nonadrop测定cDN浓度，并取相同体积的cDNA进行qPCR实验，结果显示：反转录体系中dNTP投入量的多少，极大的影响最终的浓度，但是最终的ct值基本一致，qPCR检测结果ΔCT1，对扩增基本无影响。

实验流程以及注意事项RNA的制备cDNA的制备引物设计PCR实验引物设计软件推荐

实验流程以及注意事项RNA的制备cDNA的制备引物设计PCR实验引物特异性评估使用BLAST检索，检测引物的特异性。使用PCR跑胶，判断条带是否单一。通过qPCR上机实验，设置熔解曲线，判断熔解曲线是否为单峰；通过qPCR上机实验，做标准曲线，判断扩增效率是否达标（90%-110%）

实验流程以及注意事项RNA的制备cDNA的制备引物设计PCR实验

实验流程以及注意事项RNA的制备cDNA的制备引物设计PCR实验预实验cDNA稀释浓度-forqPCR预实验确定ct值落在15-28之间的cDNA浓度。那根据Xn=x0*2n的荧光定量的数学模型计算：1copie=35cycles，假设扩增效率为100%，10copie减少3.33cycles（23.33=10）100copie减少6.64cycles（26.64=100）

实验流程以及注意事项RNA的制备cDNA的制备引物设计PCR实验阈值和ROX的设置为每种基因单独设置阈值线。引物不同的基因的最佳阈值线是不同的ROX是一种惰性染料，在qPCR反应孔中荧光信号稳定，是用于均一化校准仪器的孔间光程差和移液器差或者蒸发导致的孔间体积差异，确保各孔仪器采集的荧光值准确反应扩增产物量。

荧光定量PCR结果评定指标02

荧光定量PCR结果评定指标复孔间CT值STD0.2CT30，复孔STD0.2，说明数据重复性差如何解决：1：荧光定量反应液混合体系-混合均匀。2：提高加样的准确性，可以预先做好体系混合，然后将混合液加入每个反应管中。3：移液器定期维护校准CT30，复孔STD0.2，说明数据重复性差如何解决：1：由于泊松分布，基因拷贝数本身偏低，复孔重复性偏差。2：熔解曲线单一无杂峰，可尝试多做几个重复，分析数据时，删除重复性差的数据。3：提高加样量。

荧光定量PCR结果评定指标熔解曲线峰单一双峰或者多峰则多因为非特异性扩增、气溶胶污染、基因组污染导致，此类情况下由于非目标基因在扩增，也会发出荧光信号，荧光值更快达到阈值，从而导致ct值偏小。

荧光定量PCR结果评定指标1：确定NTC信号来源：引物二聚体、体系中污染靶分子。2：解决方案调整引物浓度、控制变量法确定污染源。3：qPCR结果评定标准：NTC熔解曲线和扩增曲线无荧光值，即无扩增出现。若有污染，可接受范围：ct（NTC）-ct（最低浓度）≥5反应体系是否存在污染

荧光定量PCR结果评定指标扩增效率是否在90%-110%之间①qPCR扩增将cDNA产物进行1、10倍、100倍稀释，每个梯度设置3个复孔，进行扩增，取得复孔间Ct平均值，取得相关Ct值。②标准曲线绘制及扩增效率计算直接在excel上计算。通过标准曲线可以获得相关的线性方程和R2值。将斜率导入扩增效率计算方程E=10（-1/斜率）-1，就可以获得相关的扩增效率，效率应在90-110%之间即可。

数据分析以及实际案例03

数据分析以及实际案例数据分析方法-绝对定量绝对定量：使用标准曲线法进行绝对定量时，可以基于已知数量对未知数量进