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荧光定量PCR常见问题-NTC/NRT有扩增

实验中经常遇到无法判断反应孔中的扩增信号是样本真实扩增还是污染扩增的情况，这就需要阴性对照来作为对比。

无模板阴性对照(NoTemplateControl,NTC)：NTC一般用纯化水代替，用以替代正常反应中的核酸样本。

无逆转录酶对照(NoReverse-TranscriptaseControl，NoRT)：NoRT是指在进行逆转录实验中不加入逆转录酶，经过此过程的cDNA在后续qPCR过程中出现了荧光信号，则代表样本中含有未去除干净的基因组DNA。

01NTC有扩增以及解决方案

NTC出现CT值，那数据是否可用，有以下2种情况

若是用的染料法扩增试剂，那扩增产物直接在qPCR仪上增加一个熔解段，来判断NTC与目的基因融解曲线峰形是否重叠。

如何增加熔解段呢？扩增产物不拿出来，qPCR仪设置扩增程序，

记得收集荧光

记得收集荧光

若NTC熔解曲线Tm值＜80℃（一般正常qPCR产物，大小在80-300bp之间，熔解曲线Tm大多在80°C以上，而一般引物二聚体的长度大约为50-60bp，熔解曲线Tm会比目的基因的小），可能是引物二聚体导致，并不影响目的基因CT值的采集。

NTC与目的基因融解曲线峰形重叠。NTC的Tm值等于目的基因的Tm值，说明体系已被气溶胶污染了。

（2）若是用探针法扩增试剂，则需要将产物进行琼脂糖电泳检测，若NTC产物大小就几十bp，比目标基因大小不一致，有可能是引物二聚体，可忽略其影响。若NTC产物的条带与目标基因的条带位置一致，大小一致，可送去一代测序，判断其序列是否与目的基因一致，若一致的话，为气溶胶污染，若不一致，那就有可能是酶、水或者环境中有其它基因的污染，引起的非特异性扩增。

那么，体系被污染，目的基因的CT值还能正常使用吗？需要计算目的基因的CT值与NTC的CT值的差值（△CT）来判定。

若△CT≥5，说明气溶胶带来的污染对体系影响非常小，可以忽略不计。

如果达不到△CT≥5的程度，△CT≥3也可以认为气溶胶的污染程度很低，目的基因的CT值可正常使用。

若△CT＜3，说明污染已经很严重了，目的基因的CT值是不能使用的。

如何消除体系中的气溶胶污染呢？

发现有污染后，立即停止所有实验，马上消毒、通风。

所有的台面、地面以及墙壁用含氯消毒剂进行喷洒消毒后，再用清水擦拭一遍，消毒液需要现用现配，24小时内使用。

仪器表面或者内标需要使用商品化的DNA污染祛除剂。

移液器内部被污染很难去除，尽量清洗或者另换一套移液器。

实验室一直保持通风，当然要保证实验室的滤网是在有效期内。

然后更换新的酶Mix、引物、模板等，进行测试，若无污染，则可开始实验。

如何避免气溶胶污染呢？

从操作上：

反应体系尽可能在超净台内或者生物安全柜中操作，减少气溶胶污染。超净台内台面需要定期使用稀释后的84消毒液进行擦拭，使用酒精棉球擦拭移液器，并使用紫外灯照射，以消除长期加样造成的核酸污染。

移液器加样时，慢吸慢放，开管盖要慢慢开，避免操作产生气溶胶。

严禁在加样房间打开qPCR产物的管盖。

避免或减少使用过强的阳性质控，可对其进行稀释。

阳性质控用的移液器与样本用的移液器分开。

所有使用的耗材、扩增用的水、试剂尽可能分成小包装，避免全部污染。

所用的枪头尽可能用带滤芯的枪头，特别是处理样本的时候。

从人员上：

加强对实验人员的培训，强调气溶胶的可怕性，实验人员要严格遵守操作规程SOP，规章制度。

从实验室上：

实验室合理布局是预防污染的根本，好的布局能够大大降低污染的概率。实验室要分试剂准备区，样本制备区、核酸扩增区和产物分析区。每个区应独立通风，不能用统一的中央空调。

实验室负压：单一流向，即只能从试剂准备区流向产物分析区。

各区物品：单独使用，实验服、拖把、移液器等仪器不能串用。

从试剂上：

使用含尿嘧啶糖苷酶（UNG）试剂，避免产物污染。

PCR核心酶特异性差，可以选用封闭技术先进（全封闭）的试剂。

聚合酶是从大肠杆菌得来，有可能会残留大肠杆菌的基因组，使用超低宿主DNA残留的酶，将宿主生物（如大肠杆菌等）的基因组DNA残留量降低到极低水平，避免宿主DNA对目标核酸的干扰。

02NRC有扩增以及解决方案

NRT有荧光信号，则代表样本中含有未去除干净的基因组DNA。

如何解决呢？

选用具有去基因组功能的RNA提取试剂。

具有去除基因组功能的反转录试剂。

gDNA具有内含子和外显子，跨内含子设计引物可以避免基因组DNA的扩增，但是，此种方法不适合具有单个外显子的基因，或者不具有内含子的物种以及基因组序列没被解析的物种等。

残留的基因组DNA会影响实验结果，从下图可以看出，图1中能看出+gDNAwiper（gDNA清除剂）+RT与-gDNA