10-qPCR实验小问题1-扩增过程中，突然断电，数据是否可用？.docxVIP

qPCR扩增过程中，突然断电，数据是否可用？

当我们将加样完的八联排或者96孔板，放置qPCR中，运行程序，进行扩增，突然实验室停电，那有可能由于样本收集不易或者实验平台不好预约的原因，等来电后，又点击继续扩增，坚持将扩增程序运行完，那这个时候就会发现扩增曲线有巨大的抖动，实验数据还能用么，今天我们从qPCR的核心原理出发，拆解qPCR是如何得到的，从而确定结果是否可用。

01先明确扩增曲线的四个阶段

01先明确扩增曲线的四个阶段

基线期：PCR最初几个循环（一般是3-15个循环）的信号水平。基线期的荧光信号变化不大，相当于背景信号或者噪音。

指数扩增期：模板充足、体系组分未消耗，荧光信号呈指数级快速上升，此阶段Ct值（循环阈值）与初始模板浓度呈严格线性负相关，是定量的核心依据；。

线性扩增期：dNTP、引物等原料开始消耗，酶活性略有下降，荧光信号上升速率逐渐放缓，扩增效率从100%逐步下降，不用于定量但可辅助判断体系状态；。

平台期：dNTP、引物基本耗尽，DNA聚合酶活性显著下降或失活，引物-模板结合达到饱和，荧光信号强度趋于稳定（部分情况因酶失活可能轻微下降），扩增效率趋近0。

02理解Ct值的含义以及由来

02理解Ct值的含义以及由来

我们知道，根据半保留复制的原则，扩增终产物Yn=X*2n，其中Yn为n循环后靶基因DNA片段终产物的拷贝数，n为扩增循环数，X为原始模板的数量。在实际扩增过程中，不可能达到理想状态下的100%的扩增效率，那公式就变为Yn=X*（1+E）n，终产物与初始产物之间有一定的倍数关系。

A

B

我们将模板5倍稀释，得到的扩增曲线如下：

假设我们固定扩增循环数（图A），即n为一个定值，Yn与X之间呈直线关系，但是观察下图就会发现，当稀释第一个5倍时，荧光强度由6500降至4500，第二个5倍时荧光强度由4500降至1500，没有线性关系，以上公式不成立。

（2）当我们固定Yn（图B），即扩增产物量，也就是后面要说的阈值，观察下图就会发现，当模板梯度稀释时，Ct值呈有规律的增加，模板浓度越低，Ct值越大。那我们可以根据以上公式进行推导，是否符合这样的实际情况呢？

由此可见，当我们固定扩增产物量（即阈值），模板初始量的lg值与Ct值呈线性关系。

（3）Ct值的特点

相同模板进行96次扩增，终产物量不恒定，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定。

Ct值则极具重现性。分析时一般取15~35，Ct值太大或太小都会影响定量分析结果的准确性。

Ct值位于指数期的开始阶段，此时样品间细小误差尚未放大且扩增效率相对恒定。

03阈值的划定

03阈值的划定

荧光阀值(threshold)：为了使得扩增效率尽量达到100%，只能设置在扩增曲线的指数增长期。它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上。-

①缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍

②手动设置：大于样本的荧光背景

③同一次反应中对于不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要设置相同的阈值。

04断电后，数据是否可用

04断电后，数据是否可用

根据上面的讲解，真正用于数据分析的阶段，是指数增长期。指数增长期板充足、体系组分未消耗，荧光信号呈指数级快速上升，符合Yn=X*2n的公式。那么断电后，根据扩增的阶段进行判断数据是否可用：

确定Ct值的位置，如果断电时，已经过了指数增长期，进入线性增长期或者是平台期，不影响阈值的划定。

同时，利用备用电源继续运行，若熔解曲线正常且与以往的数据相差不大，那本次数据是可用的。

若断电时，处于基线期，或者指数增长期刚开始，那本次数据就没办法用。