07-荧光定量PCR常见问题-CT值大，重复性差.pptxVIP

CT值大，CT值重复性差应该怎么解决

qPCR实验时，经常会遇到这2大问题：

目录01定量CT值偏大原因以及解决办法02数据重复性差原因以及解决办法

01定量CT值偏大原因以及解决办法

qPCR是利用荧光信号的累积，实时监控PCR过程，最后通过CT值以及标准曲线对未知模板进行定量的方法。什么是荧光定量PCR

什么是荧光定量PCR扩增曲线：描绘PCR进程的曲线基线期：PCR最初几个循环（一般是3-15个循环）的信号水平。基线期的荧光信号变化不大，相当于背景信号或者噪音。指数扩增期：模板充足、体系组分未消耗，荧光信号呈指数级快速上升，此阶段Ct值（循环阈值）与初始模板浓度呈严格线性负相关，是定量的核心依据；。线性扩增期：dNTP、引物等原料开始消耗，酶活性略有下降，荧光信号上升速率逐渐放缓，扩增效率从100%逐步下降，不用于定量但可辅助判断体系状态；。平台期：dNTP、引物基本耗尽，DNA聚合酶活性显著下降或失活，引物-模板结合达到饱和，荧光信号强度趋于稳定（部分情况因酶失活可能轻微下降），扩增效率趋近0

什么是荧光定量PCR阈值：基线荧光值标准差的10倍高度对应荧光强度值。穿过阈值与X轴平行的线叫阈值线。Ct值：扩增曲线穿过阈值线时的循环数。理想的Ct值范围：15-33

CT值偏大原因以及解决方法情况1：前期实验Ct值正常，本次实验所有基因扩增的Ct值都偏大情况2：第一次扩增该基因，Ct值偏大，其余基因的Ct值正常

CT值偏大原因以及解决方法-情况1情况1：前期实验Ct值正常，本次实验所有基因扩增的Ct值都偏大原因1：核酸降解了核酸降解后，Ct值会变大2-6个Ct值可以通过1%琼脂糖电泳检测RNA核酸的完整性。完整度好的RNA是有3条带，以真核生物为例，三条带分别是18s/28s/5s，且28s的亮度是18s的2倍，5s最暗。

CT值偏大原因以及解决方法-情况1情况1：前期实验Ct值正常，本次实验所有基因扩增的Ct值都偏大原因1：核酸降解了解决方案：重新提取RNA保证样本的新鲜，组织离体后要在液氮中速冻，后转移至-80℃保存。研磨组织的过程需要在液氮中研磨RNA提取过程中的上样量不超过试剂盒规定的最大上样量提取耗材避免RNase污染，选用DEPC处理的耗材避免环境以及操作者汗液、唾液中的RNase污染带一次性干净手套在洁净区操作带口罩操作，在提取过程中避免说话。

CT值偏大原因以及解决方法-情况1情况1：前期实验Ct值正常，本次实验所有基因扩增的Ct值都偏大原因2：PCR抑制剂检测方法1：设置阳性对照在反应中增加一个阳性内参，判断阳性反应孔是否受到PCR抑制或者干扰检测方法2：制作标准曲线判断将模板梯度稀释后，制作标准曲线判断

CT值偏大原因以及解决方法-情况1情况1：前期实验Ct值正常，本次实验所有基因扩增的Ct值都偏大原因2：PCR抑制剂常见的PCR抑制物：内源性：天然存在样本中的组成成分，如免疫球蛋白，蛋白酶、血红蛋白、铁蛋白、肌红蛋白、腐植类、脂类、尿素、盐离子、胆盐、多糖等外源性：苯酚、乙醇、异丙醇、EDTA、手套滑石粉、肝素抗凝剂、纤维素以及硝酸纤维素等抑制物带来的影响：干扰核酸提取中的细胞裂解降解或者包裹核酸失活热启动DNA聚合酶

CT值偏大原因以及解决方法-情况1情况1：前期实验Ct值正常，本次实验所有基因扩增的Ct值都偏大原因2：PCR抑制剂解决方案1：使用柱式提取法提取RNA利用特殊硅胶基质吸附材料，特异性吸附核酸，略过蛋白质等大分子，产物，提取得到的RNA纯度较高解决方案2：磁珠纯化RNA利用磁珠吸附游离的RNA，再通过洗涤和洗脱，得到高质量的RNA解决方案3：降低抑制物浓度增加RNA或者cDNA的稀释倍数，减小抑制物的浓度，降低对没活的干扰

CT值偏大原因以及解决方法-情况2情况2：第一次扩增该基因，Ct值偏大，其余基因的Ct值正常原因1：反应体系不合适引物失效重新合成引物1：使用PAGE胶对引物电泳检测，看大小是否正确。2.使用引物扩增阳性样本，跑胶后，判断条带的强弱、是否有弥散、是否有非特异性条带等。引物设计不合理，产物片段太长重新设计引物产物最好在80-200bp之间，超过300bp，产物片段太长，扩增效率低下。引物的扩增效率偏低重新设计引物，计算扩增效率

CT值偏大原因以及解决方法-情况2计算引物的扩增效率1：2：3：4：

CT值偏大原因以及解决方法-情况2情况2：第一次扩增该基因，Ct值偏大，其余基因的Ct值正常原因2：目的基因的表达量偏低低表达基因排除了引物设计以及操作不当的干扰外，该目的基因Ct值偏大，重复性差

CT值偏大原因以及解决方法-情况2情况2：第一次扩增该基因，Ct值偏大，其余基因的Ct值正常原因2：目的基因的表达量偏低解决方案①程序优化两步法改为三步法，延长退