蛋白质晶体结晶技术.pptVIP

第1页，共16页，星期日，2025年，2月5日蛋白质结晶的基本方法结晶的方法分3种：批量结晶、蒸发扩散结晶、液/液扩散结晶。第2页，共16页，星期日，2025年，2月5日①批量结晶。批量结晶是最古老和最简单的蛋白质结晶方法。它将所要结晶的蛋白质与结晶剂按要求的浓度在实验开始时，就混合起来以达到所要的过饱和度。实验样液的体积在50μL～几个毫升左右。由于批量结晶的样液体积较大，所以此法并不适于对最佳结晶条件的探索实验。一种改进的方法叫微量分批结晶技术。第3页，共16页，星期日，2025年，2月5日②蒸发扩散结晶。摸索蛋白质结晶条件最常用的方法是应用蒸发扩散结晶的悬滴法。因为此法不但可节省样品而且可有效利用储存空间。此法是使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加,达到过饱和状态,最终析出晶体。晶体生长的基本装置是Linbro多孔组织培养板及用二甲基二氯硅烷硅化后的玻片或塑料盖玻片。第4页，共16页，星期日，2025年，2月5日悬滴法长晶体包括以下四个步骤： 第一步,在作结晶实验之前，最好对蛋白质样品进行离心，以除去不溶解的蛋白和杂质,以减少不必要的成核中心,此外，对蛋白质样品进行超滤，也是值得推荐的。 第二步,采用“吹气法”除去培养晶体用的组织培养板和盖玻片上可能带有的灰尘。第5页，共16页，星期日，2025年，2月5日 第三步，在组织培养板的孔中加入0.2-0.5ml经过超滤的含沉淀剂及添加剂的缓冲液,作为池液,孔边缘涂上真空脂。第四步,吸1ul或2ul池液放到硅化后的盖玻片上,加等体积蛋白溶液至此池液上(这个体积比将决定平衡后的蛋白质浓度)，混合均匀，应避免气泡出现。第五步,翻转盖玻片盖在孔上,检查密封是否良好。第6页，共16页，星期日，2025年，2月5日上述方法中步骤2和4目前己可在自动化仪器中进行,但是,绝大部分拥有该仪器的实验室最终还是乐意采用手工方法。起始的条件实验常在感兴趣的区域(通常低于沉淀蛋白所需的浓度)进行，然后再进行实验条件的优化。一般的,蛋白质晶体生长所需的硫酸胺等沉淀剂浓度在理想浓度的1%或2%偏差范围内,但对于不同分子量的聚乙醇胺（PEG）则可宽松一些。晶体在数小时至数月后出现。通常，微晶可用作晶种以长出合用的晶体。第7页，共16页，星期日，2025年，2月5日蒸发扩散结晶的另一种形式是坐滴法,坐滴中含池液和蛋白溶液各1－2ul。此方法对于以下情况非常适用：即使用非离子去垢剂作为添加剂表面张力较低时；或用聚乙二醇或乙醇作为沉淀剂(由于凝结等问题,悬滴体积趋于增大)时；反向扩散导致液滴增大时；或结晶条件已确定,需要大量晶体时。第8页，共16页，星期日，2025年，2月5日③液/液扩散结晶又叫自由界面结晶。位于毛细管中的样品液约10L和结晶液由于存在浓度梯度，而在界面处发生自由扩散，从而导致蛋白质溶液的过饱和及随后的结晶。第9页，共16页，星期日，2025年，2月5日蛋白质结晶的影响因素①结晶蛋白质的纯度。获得高纯度的蛋白质是对其进行结晶的前提。Lin等通过采用FPLC快速液相色谱系统得到结晶级的蛋白质，同时发现用此法得到的蛋白质进行结晶，结晶的可重复性及获得晶体的衍射清晰度都大大提高。第10页，共16页，星期日，2025年，2月5日②过饱和度。溶液的过饱和度是蛋白质进行结晶的驱动力，其本质就是过饱和溶液的实际溶解度与饱和溶液的溶解度即该蛋白质的溶解度之间的化学势的差值。过饱和度的高低决定了结晶过程中成核及晶体生长的快慢，从而决定了晶体质量的好坏第11页，共16页，星期日，2025年，2月5日③温度。温度的变化会引起蛋白质溶解度的改变。研究表明，大多数的蛋白质的结晶是在4～22℃温度范围内进行。某些蛋白质的盐溶液在低温时的溶解度趋向升高，而在聚乙二醇及甲基丙二醇溶剂中的溶解度随温度降低而降低。第12页，共16页，星期日，2025年，2月5日