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ABI3500xL基因分析仪操作步骤

标准测序反应

质粒测序标准试验步骤

1．对质粒DNA质量和浓度要求

纯度：OD260/OD280=1.6~2.0，用量：每反应150~300ng。

2．测序PCR反应

标准反应体系：

3．测序产物纯化：

使用EdgeBio搜集柱进行纯化。

（1）离心850g，3min柱子，弃掉搜集管，换新EP管。

（2）将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上。

（3）离心850g，3min，弃掉柱子，即得纯化产物。

（4）取10μLHi-DiFormamide加入96孔板中，再加入10μL待测样品，振荡混匀离心。

PCR产物测序标准试验步骤

对PCR产物要求

纯度：OD260/OD280=1.6~2.0，用量：每反应10~100ng。强烈提议在测序前，先纯化PCR产物。

PCR产物测序PCR反应

标准反应体系：

测序产物纯化：

方法同上。

上机测序

（一）开启系统

打开电脑，检验电脑右下角处3500监控状态是否正常开启。

打开3500xL仪器电源，等候仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。

开启电脑桌面Datacollectionsoftware。

检验维护提醒：浏览维护提醒，若已完成点击。

检验耗材状态：点击“Refresh”，更新后检验仪表盘上多种耗材状态（POP7、ABC、CBC和毛细管），若指示针在可用范围内则可继续，若在指示针在红色区域中，则需更换耗材后再继续。

仪器预热：点击仪表盘上“StartPre-heat”按钮预热炉子和泳道。

（二）放置待测样品

1.检验确保橡胶隔板均通透后，将其小心盖在加有待测样品96孔板上，注意孔对孔盖好。

2.将板子放入板架中，盖好固定盖，确保全部孔全部一一对齐，即组装好测序板子。

3.按仪器TRAY按钮，使托盘出仓，以后将组装好板子放入自动采样器中，注意有标识一侧面对操作者。

（三）创建平板

1.点击CreatePlateFromTemplate，在弹出对话框中选择模板Std_Seq_Array_xL_POP7，点击Open，输入具体平板信息，包含Name,NumberofWells,PlateType,CapillaryLength,Polymer。通常具体以下。

点击屏幕下方AssignPlateContents。

输入各个孔样品名称等信息，Resultsgroup：输入结果保留路径。

选中下面控制面板上Assay，Filenameconvention，Resultsgroup三个项目。

点击LinkPlateforRun→OK。

检验屏幕上显示多种信息，确定正确无误后点击StartRun，即开启运行。

（四）监控运行

仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况。

可查看选中单孔或某一排运行情况，查看InstrumentRunViewsandFlags中各项：EPT（电流、电压、温度），Array中可查看峰图。

可编辑进样列表：反复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作。

开启、暂停或继续运行。

（五）查看结果

点击ReviewResults即可查看原始测序结果，分析结果方法见下。

分析测序结果

打开软件：双击电脑桌面SequencingAnalysisv5.4图标。

导入结果：点击工具栏中Addsamples按钮，选择路径，导入待分析测序结果。

分析：

Samplemanager中选择分析方法对测序结果进行分析。通常见BC(baseclling,将原始结果翻译为对应碱基序列)。

选中BC复选框，点击工具栏中Startanalysis按钮，即开始分析。

分析结束后，结果将自动保留为ab1格式文件。

点击工具栏中Analysisreport按钮，可查看结果状态(BCstatus)，不一样颜色代表不一样测序结果，可判定此次测序成功是否。

选中某样品前show复选框，即可查看各样品具体结果。

sequence显示碱基序列及其QV评分结果。

注意：

a.蓝色：HighQV=20+，结果可信；黄色MediumQV=15to19，需查看峰图，判定结果是否可信；红色LowQV≤15，结果不可信。

b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保留到txt文档中。

Electropherogram显示电泳峰图及序列。

Raw显示看到原始电泳图。

打印：

Samplemanager中选中P(print)复选框，点击Startanalysis绿色按钮，即可将测序结果输出为pdf格式文档。

操作注意事项

测序反应：

（1）模板：测序反应对模板质量要求很高，通常需经纯化才可使用；模板用量也有要求。