第二章基因工程的酶学基础.pptVIP

生命科学学院第二节DNA连接酶平末端DNA片段的连接(补充)3.DNA接头（adaptor）连接法问：衔接物和DNA接头有什么区别？？？衔接物（linker）是一种人工合成的双链DNA短片段，其上具有一个或数个在将与其连接的载体DNA上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规方法连接的方法，提高平齐末端间的连接作用效率。也可利用接头进行DNA平齐末端门的连接。接头（adaptor）是一种具有粘性末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与载体相连。第61页，共97页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院第三节DNA聚合酶和反转录酶DNA聚合酶3’?5’外切酶活性5’?3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高DNA聚合酶（DNApolymerase)是指能在引物和模板的存在下，将脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。分为：依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶。第62页，共97页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院第三节DNA聚合酶和反转录酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。第63页，共97页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院第三节DNA聚合酶和反转录酶CCGGGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG1.5’→3’聚合酶活性GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′2.5’→3’外切酶活性3.3’→5’外切酶活性DNA聚合酶的三种活性第64页，共97页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院第三节DNA聚合酶和反转录酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I用途：1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5’-突起端3）合成第二条cDNA4）切口移位制备探针其中用途2)和3)常用大片段第65页，共97页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院第三节DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段（一）基本性质大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即Klenow片段。Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。第66页，共97页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院第三节DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段（二）用途1.3’端补平：补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。2.DNA3’末端标记:在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。5’klenowklenow5’第67页，共97页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院第三节DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段（二）用途3.cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物第68页，共97页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院第三节DNA聚合酶和反转录酶三、T4噬菌体DNA聚合酶（一）T4DNA酶的基本特性有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性（降解单链更快）。在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外