普通微生物外源基因在细菌中的表达.pptVIP

3、外源基因的分泌产物分泌表达信号肽√释放有活性的蛋白；√免受宿主细胞中蛋白酶降解。第28页，共48页，星期日，2025年，2月5日3、外源基因的分泌产物包涵体√难溶、非正确折叠、无生物活性；√可获得大量的外源蛋白。第29页，共48页，星期日，2025年，2月5日第30页，共48页，星期日，2025年，2月5日一、基因工程药物胰岛素全球糖尿病发病人数共3.82亿，中国占到全球的四分之一，共9800万。胰岛素参与调节碳水化合物和脂肪代谢，控制血糖平衡，因此胰岛素可用于治疗糖尿病。第31页，共48页，星期日，2025年，2月5日重组人胰岛素方法一：AB链合成——已被淘汰以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融合基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。方法二：逆转录法第32页，共48页，星期日，2025年，2月5日重组人胰岛素方法一：AB链合成第33页，共48页，星期日，2025年，2月5日重组人胰岛素方法二：逆转录法第34页，共48页，星期日，2025年，2月5日普通微生物外源基因在细菌中的表达第1页，共48页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌毕赤酵母番茄叶子Hela细胞第2页，共48页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌中表达外源基因1.同源克隆获得对虾整合素的cDNA全长序列第3页，共48页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌中表达外源基因2.整合素多序列比对和空间结构分析金属离子结合位点第4页，共48页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌中表达外源基因3.整合素的βA结构域的重组与蛋白纯化M12M3456TrxβAM:蛋白marker1：pET32-integrin重组蛋白诱导前2：pET32-integrin重组蛋白诱导后3：纯化的pET32-integrin重组蛋白4：pET32诱导前5：pET32诱导后6；纯化的Trx蛋白第5页，共48页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌中表达外源基因4.整合素在大肠杆菌中大量培养及纯化第6页，共48页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌中表达外源基因5.整合素重组蛋白的活性鉴定第7页，共48页，星期日，2025年，2月5日表达载体表达载体：具有宿主细胞基因表达所需调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。第8页，共48页，星期日，2025年，2月5日克隆载体与表达载体的区别克隆载体：高拷贝、导入原核细菌、大量复制。表达载体：高拷贝或低拷贝、导入工程菌或细胞（导入的基因由克隆载体产生、高蛋白表达效率。克隆载体是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。表达载体第9页，共48页，星期日，2025年，2月5日一、外源基因的转录1、启动子 位于转录起点上游，为RNA聚合酶结合并起始转录的一段DNA控制序列。-35区：RNA聚合酶识别并结合的位点-10区：RNA聚合酶于该处解开DNA双链，并决定转录起点第10页，共48页，星期日，2025年，2月5日启动子的种类（1）Lac启动子:乳糖操纵子启动子Lac启动子受CAP（分解物激活蛋白）和cAMP的正调控第11页，共48页，星期日，2025年，2月5日启动子的种类（1）Lac启动子:(IPTG)Lac启动子受阻遏蛋白的负调控，lacUV5失去了CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)时就可启动转录。第12页，共48页，星期日，2025年，2月5日启动子的种类（2）Trp启动子:Trp启动子的阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性，因此，缺乏色氨酸时，该启动子启动，色氨酸丰富时，则停止转录。色氨酸操纵子第13页，共48页，星期日，2025年，2月5日启动子的种类（3）Tac启动子:Tac启动子是一组由Lac和Trp人工构建启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和Trp都强。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac第14页，共48页，星期日，2025年，2月5日启动子的种类（4）PL、R启动子:cI基因编码λ噬菌体基因组cI基因的温度敏感