基于体内筛选的甲醇脱氢酶活性进化与辅因子偏好改造.pdfVIP

摘要

甲醇作为一种来源广泛、价格低廉的非糖基碳源，可由煤、天然气、生物质和

CO等原料合成。利用CO合成甲醇对缓解气候危机，助力“双碳”目标实现具有积极

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意义。以甲醇为原料的生物制造技术可减少对糖基碳源的依赖，展现其作为生物制造

原料的巨大潜力。甲醇脱氢酶（Methanoldehydrogenase,MDH）是甲醇生物转化的关键

+

限速酶，其催化活性亟需提高。同时，MDH主要为NAD辅因子依赖型，催化过程主

要产生NADH形式的还原力。但某些生物合成过程需消耗大量的NADPH。因此，改

变MDH的辅因子偏好性有助于扩展其应用范围。本研究开发了一种生长偶联的筛选平

台，旨在增强MDH催化活性，并改变其辅因子偏好。

首先，本研究通过敲除EscherichiacoliMG1655中的lpd基因（编码二氢硫辛酸脱

氢酶，dihydrolipoamidedehydrogenase），构建了NADH营养缺陷菌株NADHaux，并验

证了其与NADPH营养缺陷型菌株作为体内筛选平台的可行性。随后，我们对嗜热脂肪

芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）的MDHBs构建了随机和定点饱和突变文库，并

利用这两种体内筛选平台，富集筛选出具有生长优势的菌株。通过测序确定了突变体

的氨基酸变化，并通过生长测试和全细胞催化等手段进行了复验。最终，成功获得两

个催化活性提高的MDHBs突变体S4（I58T/M292T）、S5（V37A），它们对甲醇的催化

效率（kcat/Km）分别提升了7.2和19.3倍。结构分析表明，V37A破坏了与周围氨基酸

+

残基的疏水作用。同时，本研究也获得了一个以NADP为辅因子、对甲醇酶活较高的

+

MDHBs突变体SM2，其对NADP的Km值从0.49mM下降至0.08mM。结构分析表明

突变体SM2的D195S、I196R分别与NADP+的2-磷酸基团形成了新的氢键与盐桥，有

+

利于稳定小分子NADP的结合。通过将S5的突变引入至SM2后，新突变体SM7对

++

NADP的偏好性是野生型MDH对NADP偏好性的90倍。

本研究采用生长偶联的定向进化策略成功改善了MDHBs的催化特性，为甲醇生物

+

转化提供了有用的催化元件，并为其他NAD(P)依赖酶的进化提供一个通用的筛选平

台。

关键词：生长偶联筛选；甲醇脱氢酶；辅因子工程；定向进化；甲醇生物转化

Abstract

Methanol,awidelyavailableandinexpensivenon-sugarcarbonsource,canbesynthesized

fromcoal,naturalgas,biomass,andCO.UtilizingCOformethanolsynthesisholdspromise

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inmitigatingthecurrentclimatecrisisandachievingthecarbonpeakingandcarbonneutrality

goals.Thedevelopmentofbiomanufacturingtechnologyutilizingmethanolcanreducereliance

onsugar-basedcarbonsources,rendering