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PCR技术基础及应用试题（含答案）

一、单项选择题（每题5分，共30分）

PCR技术扩增目的基因的本质是（）

A.基因重组B.DNA复制C.转录D.翻译

下列哪项不是PCR反应体系的必需成分（）

A.引物B.DNA聚合酶C.限制性内切酶D.dNTPs

PCR反应中，“变性”步骤的温度通常为（）

A.55-65℃B.72℃左右C.90-95℃D.37℃

关于引物的描述，错误的是（）

A.通常为15-30个核苷酸的短链DNA

B.两条引物分别结合目的基因的上下游

C.引物自身不能形成互补配对结构

D.引物与模板结合后无需延伸即可扩增

PCR反应的循环次数一般为（）

A.5-10次B.25-35次C.50-60次D.100次以上

实时荧光定量PCR（qPCR）与普通PCR的主要区别是（）

A.不需要引物B.可实时监测扩增过程C.无需DNA聚合酶D.扩增产物无需电泳检测

二、判断题（每题4分，共20分，正确打√，错误打×）

PCR技术中，退火温度越高，引物与模板结合的特异性越强。（）

TaqDNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，因此扩增保真度极高。（）

PCR反应中，dNTPs作为原料，提供合成DNA所需的能量和核苷酸。（）

若PCR扩增后电泳未出现条带，可能是引物设计不合理或退火温度过高。（）

巢式PCR通过两轮扩增，比普通PCR的特异性更低。（）

三、简答题（每题10分，共50分）

简述PCR技术的基本原理和三个核心步骤。

列举至少3种PCR反应中常见的抑制物，并说明其对扩增的影响。

如何判断PCR扩增产物的特异性？请写出至少2种常用方法。

比较普通PCR与实时荧光定量PCR（qPCR）在应用场景上的差异。

某实验人员进行PCR扩增后，电泳结果显示出现多条杂带，请分析可能的原因，并给出至少3种解决方案。

参考答案

一、单项选择题

B解析：PCR本质是在体外模拟DNA复制过程，实现目的基因的大量扩增。

C解析：PCR反应体系必需成分包括模板DNA、引物、Taq酶、dNTPs、缓冲液等，限制性内切酶用于酶切，非PCR必需。

C解析：变性步骤需高温（90-95℃）使模板DNA双链解旋为单链。

D解析：引物与模板结合后，需在Taq酶催化下延伸合成子链，才能完成扩增。

B解析：循环次数过少则产物量不足，过多易导致非特异性扩增，25-35次为最优范围。

B解析：qPCR通过荧光信号实时监测扩增进程，可定量分析；普通PCR需电泳检测产物，仅能定性。

二、判断题

√解析：退火温度越高，引物与模板的错配结合越难，特异性越强（但温度过高可能导致引物无法结合）。

×解析：Taq酶无3’→5’外切酶活性，缺乏校正功能，扩增保真度低于高保真酶（如Pfu酶）。

√解析：dNTPs既提供DNA合成的核苷酸原料，其磷酸键水解可释放能量供反应进行。

√解析：引物设计不合理（如特异性差）或退火温度过高（引物无法结合模板），均可能导致无扩增条带。

×解析：巢式PCR通过第一轮扩增的产物作为第二轮扩增的模板，且两轮引物特异性叠加，比普通PCR特异性更高。

三、简答题

基本原理：基于DNA半保留复制，通过引物与模板结合，在DNA聚合酶催化下，以dNTPs为原料，循环进行变性、退火、延伸，实现目的基因的指数级扩增。

三个核心步骤：①变性（90-95℃，双链DNA解旋为单链）；②退火（55-65℃，引物与模板互补结合）；③延伸（72℃左右，Taq酶催化子链合成）。

常见抑制物及影响：①血红蛋白（来自血液样本）：结合DNA聚合酶，抑制其活性；②酚/氯仿（提取残留）：破坏酶结构，导致酶失活；③EDTA（螯合剂）：结合Mg2?（Taq酶必需辅因子），降低酶活性；④多糖（植物样本中常见）：吸附DNA或酶，阻碍扩增反应。

判断特异性的方法：①琼脂糖凝胶电泳：观察扩增条带是否为单一清晰条带，且分子量与目的基因一致；②测序验证：直接测定扩增产物的核苷酸序列，与目的基因序列比对；③酶切鉴定：用特异性限制性内切酶切割产物，若能得到预期大小的酶切片段，说明特异性正确。

应用场景差异：①普通PCR：适用于目的基因的定性检测（如基因存在与否）、基因克隆、突变筛选等，需电泳验证产物；②qPCR：适用于基因的定量分析（如基因表达量检测、病原体载量测定）、快速诊断（如新冠病毒