核酸的分离纯化和鉴定.ppt

第1页，共18页，星期日，2025年，2月5日核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合而存在。分离纯化核酸总的原则:1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸结构和功能的基础；减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；避免机械剪切力以及高温煮沸；抑制DNase或RNase的活性；2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。第2页，共18页，星期日，2025年，2月5日真核DNA提取的主要步骤真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都可以用来制备基因组DNA。温和裂解细胞，溶解DNA，使DNA与组蛋白分离；采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子。第3页，共18页，星期日，2025年，2月5日外周血白细胞DNA的提取

（NaI法）原理利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核，NaI破核膜并有效解离DNA-蛋白质复合物，使核酸处于易提取状态，再以氯仿/异戊醇抽提（蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程中的泡沫产生），离心后DNA存在于上层水相中，以37%异丙醇沉淀及洗涤DNA，即获得白细胞DNA。用此法提取的DNA可用于Southern杂交、PCR的模板等。第4页，共18页，星期日，2025年，2月5日【试剂】1．6mol/LNaI2．氯仿/异戊醇(24:1V/V)混合液，应在棕色密封瓶中保存。3．异丙醇（isopropanol）(A.R)4．37%异丙醇或70%乙醇5．双蒸水(ddH2O)(高压灭菌)6．TE缓冲液(pH8.0)(10mmol/LTris-Cl、1mmol/LEDTA)高压灭菌。第5页，共18页，星期日，2025年，2月5日操作步骤取新鲜抗凝血100μl置Ep管中,离心10000rpm×1min。弃上清，加ddH2O200μl,摇匀20s。加6mol/LNaI200μl,缓慢倒置摇匀20s。于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400μl,缓慢颠倒混匀两相，离心10000rpm×10min。吸取上层水相350μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl,混匀。室温放置15min,离心14000rpm×12min。第6页，共18页，星期日，2025年，2月5日Waterphase(DNA)Waterphase(DNA)proteinsprecipitatechloroform/isoamylalcohol(lipids)STEP5第7页，共18页，星期日，2025年，2月5日小心弃去上清，再加37%异丙醇（或70%乙醇）1ml(勿摇动)，离心14000rpm×12min.小心弃异丙醇（或乙醇），于室温敞口放置直至可见的痕量液体挥发殆尽。加50μlTE缓冲液溶解DNA,以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20℃保存。第8页，共18页，星期日，2025年，2月5日标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头等用品及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。弃去异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丟失。0.54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。室温下放置16h或65℃放置1h,可加快基因组DNA沉淀的溶解。【注意事项】第9页，共18页，星期日，2025年，2月5日核酸的鉴定与分析紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。多聚酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）对目的基因进行DNA序列分析及鉴定。DNA测序基因表达分析（RNA详细结构和数量的分析）第10页，共18页，星期日，2025年，2月5日DNA的鉴定一、紫外法测DNA的纯度及浓度原理：组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。OD值为1时相当于大约50μg/ml双链DNA。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度