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2025年PCR微生物培训考核试题及答案

一、单项选择题（每题2分，共20分）

1.以下关于PCR反应体系中引物设计的描述，错误的是：

A.引物长度建议18-25个核苷酸

B.引物GC含量应控制在40%-60%

C.引物3’端避免连续3个G/C碱基

D.引物5’端可添加限制性内切酶识别序列

2.实时荧光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenI染料的作用机制是：

A.与双链DNA小沟结合发出荧光

B.与单链DNA特异性杂交发光

C.通过水解探针释放荧光基团

D.与dNTP结合后激发荧光

3.进行微生物检测时，选择16SrRNA基因作为扩增靶标的主要优势是：

A.序列保守性高，适用于种水平鉴定

B.可变区差异大，可区分不同属级分类

C.拷贝数高，提高检测灵敏度

D.仅存在于原核生物，避免真核污染

4.PCR扩增过程中，延伸阶段的最佳温度通常为：

A.55-65℃

B.72℃

C.94-95℃

D.4℃

5.以下哪种物质不是常见的PCR抑制物？

A.血液中的血红蛋白

B.粪便中的胆盐

C.植物组织中的多糖

D.超纯水中的EDTA

6.为防止PCR产物污染，实验室采用dUTP-UNG系统时，需满足的关键条件是：

A.所有PCR反应必须使用dTTP

B.UNG酶需在95℃变性阶段保持活性

C.扩增产物中需掺入dUTP

D.仅需在加样阶段添加UNG酶

7.数字PCR（dPCR）与qPCR的主要区别在于：

A.dPCR通过Ct值定量，qPCR通过终点信号定量

B.dPCR无需标准曲线，qPCR依赖标准曲线

C.dPCR使用探针法，qPCR仅用染料法

D.dPCR对抑制物更敏感

8.微生物纯培养物进行PCR检测前，常用的快速裂解方法是：

A.反复冻融（-80℃/95℃）3次

B.加入10%SDS室温孵育1小时

C.用蛋白酶K56℃消化2小时

D.超速离心（100000g）30分钟

9.以下关于内参基因（内标）的描述，正确的是：

A.内标基因需与靶基因扩增效率完全一致

B.内标仅用于监测样本核酸提取效率

C.临床样本检测中内标可替代阳性对照

D.内标基因应选择微生物特有的保守序列

10.PCR实验室分区中，产物分析区（四区）的核心操作要求是：

A.严格避免扩增产物进入前区

B.仅需配置普通生物安全柜

C.温湿度控制在25℃、60%即可

D.可与试剂准备区共用移液器

二、多项选择题（每题3分，共15分。至少2个正确选项，错选、漏选均不得分）

1.影响PCR扩增特异性的主要因素包括：

A.引物设计的特异性

B.退火温度与时间

C.dNTP浓度

D.Taq酶的延伸速度

2.微生物PCR检测中，选择靶基因的原则包括：

A.种属特异性：目标微生物特有序列

B.保守性：同一物种不同菌株间序列一致

C.长度适宜：扩增片段建议100-300bp

D.高拷贝数：提高检测灵敏度

3.以下属于PCR实验室质量控制措施的有：

A.每批次检测设置无模板对照（NTC）

B.使用定量标准品绘制标准曲线

C.每月对移液器进行校准

D.扩增仪温度均匀性验证

4.临床样本（如痰液）PCR检测前处理的目的包括：

A.裂解微生物细胞壁/膜释放核酸

B.去除蛋白质、多糖等抑制物

C.浓缩核酸提高检测灵敏度

D.灭活样本中的活病原体

5.出现qPCR扩增曲线“平台期未形成”的可能原因有：

A.模板浓度过高导致酶活性饱和

B.引物二聚体大量形成

C.dNTP或引物浓度不足

D.Taq酶活性降低

三、判断题（每题2分，共10分。正确填“√”，错误填“×”）

1.PCR反应中，Mg2+浓度过高会降低扩增特异性。（）

2.环境样本（如土壤）PCR检测时，无需进行抑制物去除，可直接扩增。（）

3.荧光探针法qPCR的特异性高于SYBRGreen染料法。（）

4.为提高灵敏度，PCR反应体系中模板添加量越多越好。（）

5.实验室发生气溶胶污染后，仅需用75%乙醇擦拭台面即可消除污染。（）

四、简答题（每题8分，共32分）

1.简述PCR技术的基本原理及三步热循环的具体作用。

2.列举5种常见的PCR污染类型，并说明对应的预防措施。

3.微生物qPCR检测中，如何通过熔解曲