基于PMA--SRCA技术精准检测猪肉及其制品中活金黄色葡萄球菌的研究.docxVIP

基于PMA--SRCA技术精准检测猪肉及其制品中活金黄色葡萄球菌的研究

一、引言

1.1研究背景

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性球菌，作为重要的人兽共患病原菌，在食品工业，尤其是肉及肉制品的生产和加工环节，其污染问题极为突出。有研究表明，在对徐州市市售生肉的检测中，金黄色葡萄球菌在猪肉和鸡肉中的检出率分别达到了30%和20%，牛肉中未检出。另有研究按照随机抽样法从某区三家农贸市场和六家超市采集110份生猪肉样品进行检测，发现金黄色葡萄球菌的检出率较高。这充分显示了金黄色葡萄球菌在猪肉及其制品中的污染较为普遍。

该菌对食品安全和人体健康存在严重危害。一方面，它能产生多种毒素和侵袭性酶，如肠毒素、表皮剥落毒素、中毒休克综合征毒素、血浆凝固酶、溶血毒素、杀白细胞素等。其中，肠毒素具有极强的抗热性，常规的巴氏消毒法和家庭烹调温度都难以破坏，人一旦食用被产肠毒素金黄色葡萄球菌污染的食物，就可能引发食物中毒，出现恶心、呕吐、腹部痉挛、水性或血性腹泻和发热等症状，严重时甚至会导致死亡。另一方面，金黄色葡萄球菌引发的感染也不容小觑，特别是对于老年人、儿童、孕妇等免疫系统较弱的人群。轻微感染可引起皮肤感染，进一步发展则可能导致人体组织局部化脓感染，更为严重时，还会引发骨髓炎、化脓性骨关节炎、心内膜炎、伪膜性肠炎、中毒性休克及脓毒血症等危险疾病，极大地威胁着人类的生命健康。此外，金黄色葡萄球菌在适宜条件下繁殖速度极快，如在污染了营养丰富的食品且生长条件适宜时，8-10h内就能迅速繁殖并产生足量肠毒素，从而引发食物中毒。

1.2研究目的和意义

准确检测猪肉及其制品中的金黄色葡萄球菌对于保障食品安全和公众健康至关重要。传统的检测方法，如依据GB4789.10—2010进行增菌分离，挑取Baird-Parker平板或血琼脂平板上可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验，虽然能获得活的病原菌，为检测结果提供有力证据，但操作繁琐、耗时长，一般需要4-5天才能完成，且难以检测出活的非可培养（Viablebutnon-culturable，VBNC）状态的细胞，这在实际检测工作中存在诸多不便，也无法满足快速检测的需求。分子检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）技术，虽然操作简单、灵敏度高，但不能有效区分活细胞和死细胞的DNA，容易导致检测结果高估，给食品安全判断带来偏差。

本研究旨在建立一种精准检测猪肉及其制品中活金黄色葡萄球菌的方法，即PMA-SRCA（叠氮溴化丙锭-跨越式滚环等温扩增）技术。PMA作为一种核酸染料，能够与死菌的DNA结合，在光照条件下发生交联反应，从而有效阻止其在后续核酸扩增反应中被扩增，实现排除死菌DNA干扰的目的，达到特异性检测活菌的效果。而SRCA技术具有等温扩增、操作简便、灵敏度高、无需特殊仪器等优点，能够在较短时间内对目标核酸进行大量扩增。将PMA与SRCA技术相结合，有望克服传统检测方法和现有分子检测方法的不足，建立一种特异、灵敏、有效的检测方法，准确检测猪肉及其制品中的活金黄色葡萄球菌。这不仅有助于及时发现食品安全隐患，采取有效措施预防食源性疾病的发生，保障消费者的身体健康，还能为食品生产企业、监管部门提供更可靠的检测手段，提升食品安全监管水平，促进食品行业的健康发展，在食源性致病菌检测领域具有重要的应用价值和实践意义。

1.3国内外研究现状

在金黄色葡萄球菌检测技术方面，国内外对传统检测方法与新兴分子检测技术均有广泛研究与应用。传统检测方法主要依据微生物培养原理，如我国国家标准GB4789.10-2010规定的方法，通过增菌、选择性平板培养、生化鉴定等步骤来检测金黄色葡萄球菌。这种方法虽然是检测的金标准，能获得活的病原菌，但操作繁琐、检测周期长，通常需要3-5天甚至更长时间才能完成，而且对检测人员的专业要求较高，在实际检测中容易受到人为因素影响，出现假阳性或假阴性结果。

随着生物技术的不断发展，新兴分子检测技术应运而生。聚合酶链式反应（PCR）技术是目前应用较为广泛的分子检测方法之一，其具有操作简单、用时短、灵敏度较高等优点，已在食品微生物检测领域得到了广泛应用。通过设计特异性引物对金黄色葡萄球菌的特定基因进行扩增，能够快速检测出样品中是否存在该菌。但PCR技术也存在局限性，它无法区分死菌和活菌的DNA，因为细菌死亡后DNA仍能留存一段时间，这就容易导致检测结果出现假阳性，在定量检测时也无法得到准确的数据。实时荧光定量PCR（qPCR）在PCR基础上加入荧光基团，通过检测荧光信号实现对目标菌的定性或定量检测，提高了检测效率和灵敏度，但其同